Hotstart Taq დნმ პოლიმერაზა
Hot Start Taq დნმ პოლიმერაზა (ანტისხეულის მოდიფიკაცია) არის ცხელი დაწყების თერმოსტაბილური დნმ პოლიმერაზა Thermus aquaticus YT-1-დან, რომელსაც გააჩნია 5'→3' პოლიმერაზული აქტივობა და 5' ფლაპ ენდონუკლეაზას აქტივობა.ცხელი დაწყების Taq დნმ პოლიმერაზა არის Taq დნმ პოლიმერაზა, რომელიც შეცვლილია თერმოლაბილური Taq ანტისხეულებით.ანტისხეულების მოდიფიკაციამ გაზარდა PCR-ის სპეციფიკა, მგრძნობელობა და გამოსავლიანობა.
კომპონენტები
| Კომპონენტი | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq ბუფერი | 4×1 მლ | 4×10 მლ | 4×50 მლ | 5×400 მლ |
| Hot Start Taq დნმ პოლიმერაზა (ანტისხეული მოდიფიცირებული) (5 U/μL) | 0,1 მლ | 1 მლ | 5 მლ | 10×5 მლ |
აპლიკაციები
10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 25℃), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPALCA-630 და 50% გლიცეროლი.
შენახვის მდგომარეობა
ტრანსპორტირება 0°C-ზე და ინახება -25°C~-15°C ტემპერატურაზე.
ერთეულის განმარტება
ერთი ერთეული განისაზღვრება, როგორც ფერმენტის რაოდენობა, რომელიც აერთიანებს 15 ნმოლ dNTP-ს მჟავაში უხსნად მასალაში 30 წუთში 75°C ტემპერატურაზე.
Ხარისხის კონტროლი
1.Endonuclease აქტივობა:20 U ფერმენტის ინკუბაციამ 4 μg pUC19 დნმ-ით 4 საათის განმავლობაში 37℃ ტემპერატურაზე არ გამოიწვია დნმ-ის შესამჩნევი დეგრადაცია, როგორც ეს განისაზღვრება გელის ელექტროფორეზით.
2.5 კბ ლამბდა PCR:5 ნგ ლამბდა დნმ-ის PCR გაძლიერების 25 ციკლი Taq დნმ პოლიმერაზას 1.25 ერთეულით 200 μM dNTPs და 0.2 μM პრაიმერების თანდასწრებით იწვევს მოსალოდნელ 5 კბ პროდუქტს.
3.ეგზონუკლეაზას აქტივობა:50 μl რეაქციის ინკუბაცია, რომელიც შეიცავს მინიმუმ 12,5 U Taq დნმ პოლიმერაზას 10 ნმოლ 5´-FAM ოლიგონუკლეოტიდთან ერთად 30 წუთის განმავლობაში 37℃ ტემპერატურაზე არ იძლევა შესამჩნევ დეგრადაციას.
4.RNase აქტივობა:10 μL რეაქციის ინკუბაციამ, რომელიც შეიცავს 20 U ფერმენტს 1 μg რნმ-ის ტრანსკრიპტებთან ერთად 2 საათის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე, არ გამოიწვია რნმ-ის შესამჩნევი დეგრადაცია, როგორც ეს განისაზღვრება გელის ელექტროფორეზით.
5.სითბოს ინაქტივაცია:არა.
რეაქციის სისტემა
| კომპონენტები | მოცულობა |
| შაბლონი დნმa | სურვილისამებრ |
| 10 μM Forward Primer | 0,5 მლ |
| 10 μM უკუ პრაიმერი | 0,5 მლ |
| dNTP Mix (თითოეული 10 მმ) | 0,5 მლ |
| 5×HC Taq ბუფერი | 5 მლ |
| Taq დნმ პოლიმერაზაბ(5 U/μL) | 0,125 მკლ |
| ნუკლეაზის გარეშე წყალი | 25 მლ-მდე |
შენიშვნები:
1) ა.
| დნმ | თანხა |
| გენომური | 1 ნგ-1 მკგ |
| პლაზმიდი ან ვირუსული | 1 პგ-1 ნგ |
2) ბ.Taq დნმ პოლიმერაზას ოპტიმალური კონცენტრაცია შეიძლება მერყეობდეს 5-50 ერთეული/მლ (0.1-0.5 ერთეული/25 μL რეაქცია) სპეციალიზებულ პროგრამებში.
თერმული ციკლის პროტოკოლი
PCR
| ნაბიჯი | ტემპერატურა(°C) | დრო | ციკლები |
| საწყისი დენატურაციაa | 95 ℃ | 1-3 წთ | - |
| დენატურაცია | 95 ℃ | 15-30 წმ | 30-35 ციკლი |
| ანეილირებაბ | 45-68 ℃ | 15-60 წმ | |
| გაფართოება | 68 ℃ | 1კბ/წთ | |
| საბოლოო გაფართოება | 68 ℃ | 5 წთ | - |
შენიშვნები:
1) საწყისი დენატურაცია 1 წთ 95°C-ზე საკმარისია გაძლიერების უმეტესობისთვის.რთული შაბლონებისთვის რეკომენდებულია უფრო ხანგრძლივი დენატურაცია 2-3 წუთის განმავლობაში 95°C ტემპერატურაზე.კოლონიური PCR-ით რეკომენდებულია საწყისი 5 წუთი დენატურაცია 95°C-ზე.
2) ანეილირების ეტაპი ჩვეულებრივ 15-60 წმ-ია.დამუშავების ტემპერატურა ეფუძნება პრაიმერის წყვილის Tm-ს და ჩვეულებრივ 45-68℃.
