Rnase ინჰიბიტორი
თაგვის RNase ინჰიბიტორი არის რეკომბინანტული თაგვის RNase ინჰიბიტორი, რომელიც გამოხატულია და გაწმენდილია E.coli-სგან.ის აკავშირებს RNase A, B ან C-ს 1:1 თანაფარდობით არაკოვალენტური კავშირის მეშვეობით, რითაც აფერხებს სამი ფერმენტის აქტივობას და იცავს რნმ-ს დეგრადაციისგან.თუმცა, ის არ არის ეფექტური RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H ან RNase ასპერგილუსისგან.თხის RNase ინჰიბიტორი გამოკვლეული იყო RT-PCR, RT-qPCR და IVT mRNA-ით და იყო თავსებადი სხვადასხვა კომერციულ უკუ ტრანსკრიპტაზებთან, დნმ პოლიმერაზებთან და რნმ პოლიმერაზებთან.
ადამიანის RNase ინჰიბიტორებთან შედარებით, თაგვის RNase ინჰიბიტორი არ შეიცავს ორ ცისტეინს, რომლებიც ძალიან მგრძნობიარეა დაჟანგვის მიმართ, რაც იწვევს ინჰიბიტორის ინაქტივაციას.რაც მას სტაბილურს ხდის DTT-ის დაბალ კონცენტრაციებში (1 მმ-ზე ნაკლები).ეს მახასიათებელი ხდის მას გამოსაყენებლად რეაქციებში, სადაც DTT-ის მაღალი კონცენტრაცია უარყოფითად მოქმედებს რეაქციაზე (მაგ. რეალურ დროში RT-PCR).
Aგანაცხადი
ეს პროდუქტი შეიძლება ფართოდ იქნას გამოყენებული ნებისმიერ ექსპერიმენტში, სადაც RNase ჩარევა შესაძლებელია რნმ-ის დეგრადაციის თავიდან ასაცილებლად, როგორიცაა:
1.cDNA-ს პირველი ჯაჭვის სინთეზი, RT-PCR, RT-qPCR და ა.შ.
2.იცავს რნმ-ს დეგრადაციისგან in vitro ტრანსკრიფციის/ტრანსლაქციის დროს (მაგ., in vitro ვირუსის რეპლიკაციის სისტემა).
3.RNase აქტივობის დათრგუნვა რნმ-ის გამოყოფისა და გაწმენდის დროს.
შენახვის პირობები
პროდუქტის შენახვა შესაძლებელია -25-15℃ ტემპერატურაზე, მოქმედებს 2 წელი.
შენახვის ბუფერი
50 მმ KCl, 20 მმ HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃), 8 მმ DTT და 50% გლიცეროლი.
ერთეულის განმარტება
თაგვის RNase ინჰიბიტორის რაოდენობა, რომელიც საჭიროა 5 ნგ რიბონუკლეაზა A-ს აქტივობის დასათრგუნად 50%-ით განისაზღვრა, როგორც ერთი ერთეული (U).
ცილის მოლეკულური წონა
თაგვის RNase ინჰიბიტორის მოლეკულური წონა არის 50 kDa.
Ხარისხის კონტროლი
ეგზონუკლეაზა აქტივობა:
40 U თაგვის RNase ინჰიბიტორი 1 μg λ-Hind III დაიჯესტით დნმ-ით 37℃ 16 საათის განმავლობაში არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.
ენდონუკლეაზის აქტივობა:
40 U თაგვის RNase ინჰიბიტორი 1μg λ დნმ-ით 37℃ 16 საათის განმავლობაში არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.
ნიკინგი აქტივობა:
40 U თაგვის RNase ინჰიბიტორი 1μg pBR322 37℃ 16 საათის განმავლობაში არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.
RNase აქტივობა:
40 U თაგვის RNase ინჰიბიტორი 1.6μg MS2 RNA 4 საათის განმავლობაში 37℃ ტემპერატურაზე არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.
E.coli დნმ:
40 U თაგვის RNase ინჰიბიტორი სკრინინგდება E. coli-ს გენომიური დნმ-ის არსებობისთვის TaqMan qPCR-ის გამოყენებით E. coli 16S rRNA ლოკუსისთვის სპეციფიკური პრაიმერებით.E. coli-ს გენომიური დნმ-ის დაბინძურება არის ≤ 0.1 pg/40 U.
Nოტეs
1. ძალადობრივი რხევა ან მორევა გამოიწვევს ფერმენტის ინაქტივაციას.
2. ამ ინჰიბიტორის ოპტიმალური ტემპერატურის დიაპაზონი იყო 25-55 ℃ და ის ინაქტივირებული იყო 65℃ და ზემოთ.
3. RNase H, RNase 1 და RNase T1 აქტივობა არ იყო ინჰიბირებული თაგვის RNase ინჰიბიტორით.
4. RNase-ის აქტივობის დათრგუნვა დაფიქსირდა pH-ის ფართო დიაპაზონში (pH 5-9 იყო ყველა აქტიური), და უმაღლესი აქტივობა დაფიქსირდა pH 7-8-ზე.
5. ვინაიდან რიბონუკლეაზები, როგორც წესი, ინარჩუნებენ აქტივობას დენატურაციის პირობებში, სიფრთხილე უნდა იქნას მიღებული, რათა თავიდან იქნას აცილებული RNase ინჰიბიტორის მოლეკულების დენატურაცია, რომლებიც კომპლექსურია რიბონუკლეაზასთან.აქტიური რიბონუკლეაზას გამოყოფის თავიდან ასაცილებლად, თავიდან უნდა იქნას აცილებული 50 °C-ზე მეტი ტემპერატურა და შარდოვანა ან სხვა დენატურირებული აგენტების მაღალი კონცენტრაცია.
