უნივერსალური SYBR GREEN qPCR Premix (ლურჯი)
კატის ნომერი: HCB5041B
უნივერსალური ლურჯი qPCR Master Mix (საღებავებზე დაფუძნებული) არის წინასწარი ხსნარი 2×რეალურ დროში რაოდენობრივი PCR გამაძლიერებლისთვის, რომელიც ხასიათდება მაღალი მგრძნობელობითა და სპეციფიკურობით, არის ლურჯი ფერის და აქვს ნიმუშის დამატების მიკვლევის ეფექტი.ძირითადი კომპონენტი Taq დნმ პოლიმერაზა იყენებს ანტისხეულების ცხელ დაწყებას, რათა ეფექტურად დათრგუნოს არასპეციფიკური გაძლიერება ნიმუშის მომზადების დროს პრაიმერის ანეილირების გამო.ამავდროულად, ფორმულა ამატებს ხელშემწყობ ფაქტორებს PCR რეაქციის ამპლიფიკაციის ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად და გენების გაძლიერების გასათანაბრებლად სხვადასხვა GC შემცველობით (30 ~ 70%), ასე რომ რაოდენობრივმა PCR-მა შეიძლება მიიღოს კარგი ხაზოვანი ურთიერთობა ფართო რაოდენობრივად. რეგიონი.ეს პროდუქტი შეიცავს სპეციალურ ROX Passive Reference Dye-ს, რომელიც გამოიყენება qPCR ინსტრუმენტების უმეტესობისთვის.არ არის საჭირო ROX-ის კონცენტრაციის რეგულირება სხვადასხვა ინსტრუმენტზე.საჭიროა მხოლოდ პრაიმერებისა და შაბლონების დამატება რეაქციის სისტემის გასაძლიერებლად მოსამზადებლად.
კომპონენტები
უნივერსალური ლურჯი qPCR Master Mix
შენახვის პირობები
პროდუქტი იგზავნება ყინულის პაკეტებით და ინახება -25℃~-15℃ ტემპერატურაზე 18 თვის განმავლობაში.რეაქციის სისტემის შენახვისას ან მომზადებისას აუცილებელია ძლიერი სინათლის დასხივების თავიდან აცილება.
სპეციფიკაცია
| კონცენტრაცია | 2× |
| გამოვლენის მეთოდი | SYBR |
| PCR მეთოდი | qPCR |
| პოლიმერაზა | Taq დნმ პოლიმერაზა |
| ნიმუშის ტიპი | დნმ |
| აპლიკაციის აღჭურვილობა | qPCR ინსტრუმენტების უმეტესობა |
| Პროდუქტის ტიპი | SYBR პრემიქსი რეალურ დროში ფლუორესცენციის რაოდენობრივი PCR-ისთვის |
| მიმართვა (განაცხადზე) | გენის გამოხატულება |
ინსტრუქციები
1.რეაქციის სისტემა
| კომპონენტები | მოცულობა (μL) | მოცულობა (μL) | საბოლოო კონცენტრაცია |
| უნივერსალური SYBR GREEN qPCR პრემიქსი | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10μmol/L) | 1 | 0.4 | 0.2 μmol/L |
| საპირისპირო პრაიმერი (10 μmol/L) | 1 | 0.4 | 0.2 μmol/L |
| დნმ | X | X | |
| ddH2O | 50-მდე | 20-მდე | - |
[შენიშვნა]: გამოყენებამდე კარგად აურიეთ, რათა თავიდან აიცილოთ ზედმეტი ბუშტები ძლიერი შერყევის შედეგად.
ა) პრაიმერის კონცენტრაცია: პრაიმერის საბოლოო კონცენტრაცია არის 0.2 μmol/L და ასევე შეიძლება დარეგულირდეს 0.1-დან 1.0μmol/L-მდე, როგორც საჭიროა.
ბ) შაბლონის კონცენტრაცია: თუ შაბლონი არის განუზავებელი cDNA მარაგის ხსნარი, გამოყენებული მოცულობა არ უნდა აღემატებოდეს qPCR რეაქციის მთლიანი მოცულობის 1/10-ს.
გ) შაბლონის განზავება: რეკომენდებულია cDNA მარაგის ხსნარის 5-10-ჯერ განზავება.დამატებული შაბლონის ოპტიმალური რაოდენობა უკეთესია, როდესაც ამპლიფიკაციით მიღებული Ct მნიშვნელობა არის 20-30 ციკლი.
დ) რეაქციის სისტემა: სამიზნე გენის გაძლიერების ეფექტურობისა და განმეორებადობის უზრუნველსაყოფად რეკომენდებულია 20μL ან 50μL გამოყენება.
ე) სისტემის მომზადება: გთხოვთ, მოამზადოთ სუპერ სუფთა სკამზე და გამოიყენოთ წვერები და რეაქციის მილები ნუკლეაზის ნარჩენების გარეშე;რეკომენდებულია რჩევების გამოყენება ფილტრის ვაზნებით.მოერიდეთ ჯვარედინი დაბინძურებას და აეროზოლებით დაბინძურებას.
2.რეაქციის პროგრამა
სტანდარტული პროგრამა
| ციკლის ნაბიჯი | Ტემპი. | დრო | ციკლები |
| საწყისი დენატურაცია | 95℃ | 2 წთ | 1 |
| დენატურაცია | 95℃ | 10 წმ | 40 |
| ანეილირება/გაფართოება | 60℃ | 30 წამი★ | |
| დნობის მრუდის ეტაპი | ინსტრუმენტის ნაგულისხმევი | 1 | |
სწრაფი პროგრამა
| ციკლის ნაბიჯი | Ტემპი. | დრო | ციკლები |
| საწყისი დენატურაცია | 95℃ | 30 წმ | 1 |
| დენატურაცია | 95℃ | 3 წმ | 40 |
| ანეილირება/გაფართოება | 60℃ | 20 წამი★ | |
| დნობის მრუდის ეტაპი | ინსტრუმენტის ნაგულისხმევი | 1 | |
[შენიშვნა]: სწრაფი პროგრამა შესაფერისია გენების აბსოლუტური უმრავლესობისთვის და სტანდარტული პროგრამების გამოყენება შესაძლებელია ცალკეული რთული მეორადი სტრუქტურის გენებისთვის.
ა) დამუშავების ტემპერატურა და დრო: გთხოვთ დაარეგულიროთ პრაიმერის და სამიზნე გენის სიგრძის მიხედვით.
ბ) ფლუორესცენტური სიგნალის მიღება (★): გთხოვთ, დააყენოთ ექსპერიმენტული პროცედურა ინსტრუმენტის გამოყენების ინსტრუქციებში მოცემული მოთხოვნების შესაბამისად.
გ) დნობის მრუდი: ინსტრუმენტის ნაგულისხმევი პროგრამა შეიძლება გამოყენებულ იქნას ნორმალურად.
3. შედეგების ანალიზი
რაოდენობრივი ექსპერიმენტებისთვის საჭირო იყო მინიმუმ სამი ბიოლოგიური გამეორება.რეაქციის შემდეგ საჭიროა გაძლიერების მრუდის და დნობის მრუდის დადასტურება.
3.1 გაძლიერების მრუდი:
სტანდარტული გაძლიერების მრუდი არის S- ფორმის.რაოდენობრივი ანალიზი ყველაზე ზუსტია, როდესაც Ct-ის მნიშვნელობა ეცემა 20-დან 30-მდე. თუ Ct მნიშვნელობა 10-ზე ნაკლებია, საჭიროა შაბლონის განზავება და ტესტის ხელახლა ჩატარება.როდესაც Ct-ის მნიშვნელობა 30-35-ს შორისაა, საჭიროა შაბლონის კონცენტრაციის ან რეაქციის სისტემის მოცულობის გაზრდა, რათა გაუმჯობესდეს გამაძლიერებელი ეფექტურობა და უზრუნველყოფილი იყოს შედეგების ანალიზის სიზუსტე.როდესაც Ct-ის მნიშვნელობა 35-ზე მეტია, ტესტის შედეგები ვერ ახერხებს გენის ექსპრესიის რაოდენობრივ ანალიზს, მაგრამ შეიძლება გამოყენებულ იქნას თვისებრივი ანალიზისთვის.
3.2 დნობის მრუდი:
დნობის მრუდის ერთი პიკი მიუთითებს, რომ რეაქციის სპეციფიკა კარგია და რაოდენობრივი ანალიზი შეიძლება ჩატარდეს;თუ დნობის მრუდი აჩვენებს ორმაგ ან მრავალჯერადი მწვერვალს, რაოდენობრივი ანალიზი შეუძლებელია.დნობის მრუდი გვიჩვენებს ორმაგ მწვერვალებს და აუცილებელია ვიმსჯელოთ, არის თუ არა სამიზნე პიკი პრაიმერის დიმერი თუ არასპეციფიკური გაძლიერება დნმ-აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.თუ ეს არის პრაიმერის დიმერი, რეკომენდირებულია პრაიმერის კონცენტრაციის შემცირება ან პრაიმერების გადამუშავება მაღალი გამაძლიერებელი ეფექტურობით.თუ ეს არის არასპეციფიკური გაძლიერება, გთხოვთ გაზარდოთ ანეილირების ტემპერატურა, ან გადააკეთოთ პრაიმერები სპეციფიკურობით.
შენიშვნები
გთხოვთ, ატაროთ საჭირო PPE, ასეთი ლაბორატორიული ქურთუკი და ხელთათმანები, თქვენი ჯანმრთელობისა და უსაფრთხოების უზრუნველსაყოფად!
ეს პროდუქტი განკუთვნილია მხოლოდ კვლევისთვის!
