RTL საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა
RTL საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა არის რნმ შაბლონზე დამოკიდებული დნმ პოლიმერაზა, რომელსაც არ გააჩნია 3'→5' ეგზონუკლეაზას აქტივობა და აქვს RNase H აქტივობა.ამ ფერმენტს შეუძლია გამოიყენოს რნმ, როგორც შაბლონი დნმ-ის დამატებითი ჯაჭვის სინთეზისთვის, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას პირველი ჯაჭვის cDNA სინთეზისთვის, განსაკუთრებით RT-LAMP-ისთვის (მარყუჟის შუამავლობით იზოთერმული გაძლიერება).RTL საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა 1.0-თან შედარებით, მგრძნობელობა მნიშვნელოვნად გაუმჯობესებულია, თერმული სტაბილურობა უფრო ძლიერია და რეაქცია 65°C-ზე უფრო სტაბილურია.RTL საპირისპირო ტრანსკრიპტაზა (გლიცეროლის გარეშე) შეიძლება გამოყენებულ იქნას ლიოფილიზებული პრეპარატების, ლიოფილიზებული RT-LAMP რეაგენტების მოსამზადებლად და ა.შ.
ერთეულის განმარტება
ერთი ერთეული აერთიანებს 1 ნმოლ dTTP-ს მჟავა-ნალექ მასალაში 20 წუთში 50°C ტემპერატურაზე poly(A)•oligo(dT)25 შაბლონის პრაიმერის გამოყენებით.
კომპონენტები
| Კომპონენტი | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL უკუ ტრანსკრიპტაზა (გლიცეროლის გარეშე) (15 U/μL) | 0,1 მლ | 1 მლ | 10 მლ |
| 10×HC RTL ბუფერი | 1,5 მლ | 4×1,5 მლ | 5×10 მლ |
| MgSO4 (100 მმ) | 1,5 მლ | 2×1,5 მლ | 3×10 მლ |
შენახვის მდგომარეობა
ტრანსპორტირება 0°C-ზე და ინახება -25°C~-15°C ტემპერატურაზე.
Ხარისხის კონტროლი
- ნარჩენი აქტივობაEენდონუკლეაზა:50 μL რეაქცია, რომელიც შეიცავს 1 μg λDNA და 15 ერთეული RTL2.0, ინკუბირებულია 16 საათის განმავლობაში 37 ℃ ტემპერატურაზე, აჩვენებს იგივე ნიმუშს, როგორც უარყოფით კონტროლს გელის ელექტროფორეზით.
- ნარჩენი აქტივობაეგზონუკლეაზა:50 μL რეაქცია, რომელიც შეიცავს 1 μg Hind Ⅲ მონელებული λDNA და 15 ერთეული RTL2.0 ინკუბირებული 16 საათის განმავლობაში 37 ℃ გვიჩვენებს იგივე ნიმუშს, როგორც უარყოფით კონტროლს გელის ელექტროფორეზით.
- ნარჩენი აქტივობანიკასე:50 μL რეაქცია, რომელიც შეიცავს 1 მკგ ზეგადახვეულ pBR322-ს და 15 ერთეულ RTL2.0-ს, ინკუბირებული 4 საათის განმავლობაში 37°C-ზე, აჩვენებს იგივე ნიმუშს, როგორც უარყოფით კონტროლს გელის ელექტროფორეზით.
- ნარჩენი აქტივობაRNase:10 μL რეაქცია, რომელიც შეიცავს 0,48 μg MS2 RNA და 15 ერთეული RTL2.0, ინკუბირებულია 4 საათის განმავლობაში 37°C-ზე, აჩვენებს იგივე ნიმუშს, როგორც უარყოფით კონტროლს გელის ელექტროფორეზით.
- E. coli gდნმ:გაზომილი ერთადე.კოლისპეციფიკური HCD გამოვლენის ნაკრები, RTL2.0-ის 15 ერთეული შეიცავს 1-ზე ნაკლებსE. coliგენომი.
რეაქციის დაყენება
cDNA სინთეზის პროტოკოლი
| კომპონენტები | მოცულობა |
| შაბლონი რნმ ა | სურვილისამებრ |
| ოლიგო(dT) 18~25(50მმ) ან შემთხვევითი პრაიმერის ნარევი (60მმ) | 2 მლ |
| dNTP Mix (თითოეული 10 მმ) | 1 მლ |
| RNase ინჰიბიტორი (40 U/UL) | 0,5 მლ |
| RTL უკუ ტრანსკრიპტაზა 2.0 (15 ე/მლ) | 0,5 მლ |
| 10×HC RTL ბუფერი | 2 მლ |
| ნუკლეაზის გარეშე წყალი | 20 მლ-მდე |
შენიშვნები:
1) სულ რნმ-ის რეკომენდებული დოზაა 1ნგ~1მკგ
2) mRNA-ს რეკომენდებული დოზა იყო 50ng~100ng
თერმო-ველოსიპედით სიარული რუტინის პირობები რეაქცია:
| ტემპერატურა (°C) | დრო |
| 25 °Ca | 5 წთ |
| 55 °C | 10 წთb |
| 80 °C | 10 წთ |
შენიშვნები:
1) თუ გამოიყენება შემთხვევითი პრაიმერის ნარევი, ინკუბაციის ეტაპი 25°C-ზე.
2) თუ გამოიყენება სამიზნე პრაიმერის ნარევი, ინკუბაციის ეტაპი 55°C-ზე 10-30 წუთის განმავლობაში.
RT-LAMP პროტოკოლი
| კომპონენტები | მოცულობა | საბოლოო კონცენტრაცია |
| შაბლონი რნმ | სურვილისამებრ | ≥10 ეგზემპლარი |
| dNTP Mix (10mM) | 3,5 მლ | 1.4 მმ |
| FIP/BIP პრაიმერები (25×) | 1 მლ | 1.6 მკმ |
| F3/B3 პრაიმერი (25×) | 1 მლ | 0.2 მკმ |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 მლ | 0.4 მკმ |
| RNase ინჰიბიტორი (40 U/μL) | 0,5 მლ | 20 ე/რეაქცია |
| RTL უკუ ტრანსკრიპტაზა 2.0 (15 U/μL) | 0,5 მლ | 7.5 ე/რეაქცია |
| Bst V2 დნმ პოლიმერაზა (8U/μL) | 1 მლ | 8 U/რეაქცია |
| MgSO4 (100 მმ) | 1.5 მლ | 6 მმ (სულ 8 მმ) |
| 10×HC RTL ბუფერი (ან 10×HC Bst V2 ბუფერი) | 2,5 მლ | 1 × (2 მმ მგ2+) |
| ნუკლეაზის გარეშე წყალი | 25 მლ-მდე | - |
შენიშვნები:
1) აურიეთ მორევით და მოკლედ ცენტრიფუგა, რათა შეაგროვოთ.მუდმივი ტემპერატურის ინკუბაცია 65°C-ზე 1 საათის განმავლობაში.
2) ორი ბუფერი ურთიერთმოქმედია და აქვთ იგივე შემადგენლობა.
შენიშვნები
1. ეს პროდუქტი -20 °C-ზე შენახვისას წარმოიქმნება თეთრი მყარი.გამოიღეთ -20°C-დან და დადგით ყინულზე დაახლოებით 10 წუთის განმავლობაში.დნობის შემდეგ მისი გამოყენება შესაძლებელია შერყევის გზით და შერევით.
2. cDNA პროდუქტის შენახვა შესაძლებელია -20°C ან -80°C ტემპერატურაზე ან გამოყენებული იქნას დაუყოვნებლივ PCR რეაქციისთვის.
3. RNase დაბინძურების თავიდან ასაცილებლად, გთხოვთ, შეინარჩუნოთ ექსპერიმენტული ადგილი სუფთად და აცვიათ სუფთა ხელთათმანები და ნიღბები ოპერაციის დროს.
