მცენარეთა პირდაპირი PCR ნაკრები

კატის ნომერი: HCR2020A

Plant Direct PCR ნაკრები შესაფერისია მცენარის ფოთლების, თესლების და ა.შ. პირდაპირი გაძლიერებისთვის და შეიძლება გამოყენებულ იქნას მცენარეთა ნიმუშების მაღალი გამტარიანობის სკრინინგისთვის, რომლებიც არ შეიცავს პოლისაქარიდებს და პოლიფენოლებს.დნმ პოლიმერაზას პირდაპირი გაძლიერება მიმართულ ევოლუციაზე დაფუძნებული აქვს უმაღლესი ტოლერანტობა მცენარეებში PCR ინჰიბიტორების მიმართ.იმავდროულად, ის ინარჩუნებს გაძლიერების მაღალ შესრულებას, რაც შესაფერისია დნმ-ის ფრაგმენტების გაძლიერებისთვის 5 კბ-ის ფარგლებში.უნიკალური Lysis ბუფერი A კომპლექტში შეიძლება გამოყენებულ იქნას ახალი ან გაყინული მცენარის ქსოვილების დასალიზებლად.მისი ფუნქციონირება მარტივია და ლიზატი შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც შაბლონი გამაძლიერებლობისთვის გაწმენდის გარეშე.სისტემა შეიცავს დამცავ აგენტებს, რომლებიც საშუალებას აძლევს ნედლი ნიმუშების ეფექტურად გაძლიერებას განმეორებითი გაყინვისა და გალღობის შემდეგ.2 × Plant Direct Master Mix-ს მხოლოდ პრაიმერებისა და შაბლონების დამატება სჭირდება ამპლიფიკაციის რეაქციის შესასრულებლად, რითაც შეამცირებს პიპეტინგის ოპერაციებს და აუმჯობესებს გამოვლენის გამტარუნარიანობას და შედეგების გამეორებას.

კომპონენტები

*Plant Direct Lysis Buffer B არის არჩევითი რეაგენტი, რომელიც გამოიყენება მცენარეთა პირდაპირი ლიზისის ბუფერი A გასანეიტრალებლად, ნიმუშების შენახვის დროის გასახანგრძლივებლად.მისი გამოყენება შესაძლებელია რეალური სიტუაციიდან გამომდინარე.

შენახვის პირობები

2 × Plant Direct Master Mix, შეინახეთ -30 ~ -15℃ ტემპერატურაზე და მოერიდეთ განმეორებით გაყინვას და გალღობას;დარგეთ პირდაპირი ლიზის ბუფერი, შეინახეთ -30 ~ -15 ℃ ან 2 ~ 8 ℃ ტემპერატურაზე.

ექსპერიმენტის პროცესი

ნიმუშის დამუშავება-მცენარის ფოთოლი

პირდაპირი მეთოდი:რეკომენდებულია ახალგაზრდა ფოთლების გამოყენება.გამოიყენეთ ხვრელი 0,5 – 3 მმ ფიქსირებული დიამეტრით მცირე და ერთგვაროვანი ნიმუშის მისაღებად და შემდეგ პირდაპირ დაამატეთ ნიმუში PCR სისტემაში (რეკომენდებულია 50 μl სისტემა).შენიშვნა, დარწმუნდით, რომ ნიმუში არის PCR ხსნარში და არა მილის კედელთან.თუ პირდაპირი PCR გამოიყენება გრძელი ფრაგმენტების და რთული ნიმუშების გასაძლიერებლად, უფრო მცირე დიამეტრის (0,5 – 1 მმ) ნიმუშის შაბლონად გამოყენება დაგეხმარებათ უკეთესი შედეგების მიღებაში.

დაფქვის ლიზის მეთოდი:რეკომენდებულია ახალგაზრდა ფოთლების გამოყენება.აიღეთ ფოთლის პატარა ნაჭერი (დაახლოებით 1 – 3 მმ დიამეტრის), მოათავსეთ 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab-ში და შეძლებისდაგვარად გახეხეთ (ეს ნაბიჯი შეიძლება გაკეთდეს ფოთლის 100 μl პიპეტის წვერით დაჭერით. ნიმუშის ბადაგი) .თუ გამოიყენება უფრო დიდი მოცულობის ფოთლის ქსოვილი (არაუმეტეს 7 მმ), გაზარდეთ განზავების ბუფერის მოცულობა 50 μl-მდე.ფოთლების დაფქვის შემდეგ ხსნარი უნდა გამოჩნდეს მწვანე.ხანმოკლე ცენტრიფუგაციის შემდეგ, დაამატეთ 1 μl სუპერნატანტი PCR სისტემაში, როგორც რეაქციის შაბლონი.

თერმული ლიზის მეთოდი:რეკომენდებულია ახალგაზრდა ფოთლების გამოყენება.აიღეთ ფოთლის პატარა ნაჭერი (დაახლოებით 1 - 3 მმ დიამეტრის), მოათავსეთ 20 μl მცენარეთა პირდაპირი ლიზის ბუფერ A-ში და გაათბეთ 95°C-ზე 5-10 წუთის განმავლობაში.ლიზისის დრო შეიძლება სათანადოდ გაგრძელდეს ფოთლებზე, რომლებიც ძნელად იხსნება (არაუმეტეს 20 წთ).თუ გამოიყენება უფრო დიდი მოცულობის ფოთლის ქსოვილი (არაუმეტეს 7 მმ), გაზარდეთ განზავების ბუფერის მოცულობა 50 μl-მდე.გაცხელების შემდეგ, მოკლედ მოათავსეთ ცენტრიფუგა და დაამატეთ 1 მკლ სუპერნატანტი PCR სისტემაში, როგორც რეაქციის შაბლონი.

ნიმუშის დამუშავება- მცენარის თესლი

დაფქვის ლიზის მეთოდი:გამოიყენეთ სკალპელი 5 მმ დიამეტრის თესლების მოსაჭრელად, დაამატეთ ისინი 100 მკლ მცენარეთა პირდაპირი ლიზის ბუფერ A-ს და გახეხეთ ნიმუში პიპეტის წვერით ან სხვა ხელსაწყოებით.მოკლედ მოურიეთ და გააჩერეთ ოთახის ტემპერატურაზე 3-5 წთ.დარწმუნდით, რომ თესლის ნიმუში ჩაძირულია განზავების ბუფერში.ხანმოკლე ცენტრიფუგაციის შემდეგ, დაამატეთ 1 μl სუპერნატანტი PCR სისტემაში, როგორც რეაქციის შაბლონი.

თერმული ლიზის მეთოდი:გამოიყენეთ სკალპელი 5 მმ დიამეტრის თესლის მოსაჭრელად, დაამატეთ ისინი 100 მკლ მცენარეთა პირდაპირი ლიზისის ბუფერ A-ს და გაათბეთ 95°C-ზე 5-10 წუთის განმავლობაში.ლიზისის დრო შეიძლება სათანადოდ გაგრძელდეს ფოთლებისთვის, რომლებიც ძნელად იხსნება (არაუმეტეს 30 წთ).გაცხელების შემდეგ, მოკლედ გააკეთეთ ცენტრიფუგა და დაამატეთ 1 მკლ სუპერნატანტი PCR სისტემაში, როგორც რეაქციის შაბლონი.

ა.მაკრატელი ან სხვა ხელსაწყოები ასევე შეიძლება გამოყენებულ იქნას შესაბამისი ზომის ნიმუშების მოსაჭრელად;თუ პუნჩი ან მაკრატელი ხელახლა გამოიყენება, ისინი უნდა გაიწმინდოს 2% ნატრიუმის ჰიპოქლორიტის ხსნარით ყოველი გამოყენების წინ, რათა თავიდან იქნას აცილებული ნიმუშებს შორის ჯვარედინი დაბინძურება.

ბ.გამოყენებამდე დარწმუნდით, რომ მცენარეთა პირდაპირი ლიზისის ბუფერი მთლიანად დნება.თუ ბუფერი ბლანტია ან აქვს ნალექები, ის შეიძლება გაცხელდეს 37℃ ტემპერატურაზე, რომ მთლიანად გადნება გამოყენებამდე.

გ.რეაქციის სისტემაში შაბლონის მოცულობა შეიძლება სათანადოდ დარეგულირდეს მცენარეული მასალისა და დამატებული გამხსნელის მოცულობის სხვაობის მიხედვით.

მცენარეთა პირდაპირი ლიზის ბუფერი

მცენარეთა პირდაპირი ლიზის ბუფერი A, რომელიც შეიცავს ამ პროდუქტს, მკაცრად ოპტიმიზირებულია მცენარეთა უმეტესი ქსოვილის გენომის გასათავისუფლებლად და შესაფერისია ნედლი მცენარეების მოკლევადიანი შესანახად 4℃ ტემპერატურაზე.თუ ნიმუშის შენახვა საჭიროა უფრო ხანგრძლივი დროის განმავლობაში (მაგ. 1-2 თვე), რეკომენდებულია სუპერნატანტის გადატანა ახალ EP მილში და შენახვა -20℃ ტემპერატურაზე.ნიმუშების უფრო სტაბილურად შესანახად, გადატანილ სუპერნატანს დაუმატეთ თანაბარი მოცულობის Plant Direct Lysis Buffer B, კარგად აურიეთ და შეინახეთ -20℃.სტაბილური შენახვის დრო განსხვავდება მცენარის ნიმუშებისა და მდგომარეობის მიხედვით.

რეაქციის სისტემა

ა.იგი შეიცავს Mg²⁺საბოლოო კონცენტრაციით 2 მმ.

ბ.რეკომენდირებულია გამოიყენოს საბოლოო კონცენტრაცია 0.4μM თითოეული პრაიმერისთვის.პრაიმერების გადაჭარბებული გამოყენება გამოიწვევს არასპეციფიკურ გაძლიერებას.

გ.გამოყენებული ნიმუშის რაოდენობა შეიძლება დარეგულირდეს ფაქტობრივი სიტუაციის მიხედვით.ნედლი ლიზირებული ნიმუშის ერთ რეაქციაში გამოყენებული რაოდენობა შეიძლება დარეგულირდეს რეაქციის მთლიანი მოცულობის 2%-20%-ს შორის.ნიმუშების ზედმეტად გამოყენებამ შეიძლება გამოიწვიოს გაძლიერების უკმარისობა.

რეაქციის პროგრამა

ა.საწყისი დენატურაცია (98℃, 5 წთ) ხელს უწყობს მცენარის ქსოვილის ლიზას, ათავისუფლებს გენომიურ დნმ-ს, რომელიც შეიძლება გამოყენებულ იქნას PCR გაძლიერებისთვის.არ შეამციროთ დრო და არ შეამციროთ ტემპერატურა.

ბ.რეკომენდებულია მისი დაყენება პრაიმერის Tm მნიშვნელობის ტოლი ან 2 ~ 4℃ უფრო მაღალი ვიდრე Tm მნიშვნელობა.ამ პროდუქტში გამოყენებული პირდაპირი გამაძლიერებელი დნმ პოლიმერაზა განსხვავდება ჩვეულებრივი Taq დნმ პოლიმერაზასგან და აქვს სპეციალური მოთხოვნები რეაქციის გამოწვის ტემპერატურის მიმართ. მაღალი ანეილირების ტემპერატურის გამოყენებამ შეიძლება ეფექტურად შეამციროს არასპეციფიკური გაძლიერება და გააუმჯობესოს გაძლიერების ეფექტურობა.კომპლექსური შაბლონებისთვის ეფექტური გაძლიერება შეიძლება მიღწეული იყოს ანეილირების ტემპერატურის რეგულირებით და გაფართოების დროის გახანგრძლივებით.

გ.თუ გამაძლიერებელი პროდუქტის სიგრძეა ≤1 კბ, გაფართოების დრო დგინდება 30 წმ/კბ;თუ გამაძლიერებელი პროდუქტის სიგრძეა >1 კბ, გაფართოების დრო დგინდება 60 წმ/კბ.

დ.რთული ნიმუშებისთვის ან დაბალი გამაძლიერებლობის მქონე ნიმუშებისთვის, ციკლების რაოდენობა შეიძლება სათანადოდ გაიზარდოს 40-50 ციკლამდე.

აპლიკაციები

იგი გამოიყენება მცენარეთა ქსოვილების პირდაპირი გაძლიერებისთვის და მცენარეთა ნიმუშების მაღალი გამტარიანობის სკრინინგისთვის, რომლებიც არ შეიცავს პოლისაქარიდებს და პოლიფენოლებს.

შენიშვნები

მხოლოდ კვლევისთვის.არ გამოიყენება სადიაგნოსტიკო პროცედურებში.

1. ნედლი მცენარის ამპლიფიკაციის ან პირდაპირი ამპლიფიკაციისთვის, რეკომენდირებულია გამოიყენოთ გაწმენდილი გენომის დნმ, როგორც დადებითი კონტროლი ექსპერიმენტის დაწყებამდე, რათა უზრუნველყოს სისტემის, პრაიმერების და ოპერაციების სისწორე.

2. ამ კომპლექტში გამოყენებული პირდაპირი გამაძლიერებელი დნმ პოლიმერაზას აქვს ძლიერი კორექტირების აქტივობა.თუ საჭიროა TA კლონირების ჩატარება, რეკომენდებულია დნმ-ის გაწმენდა ადენინის დამატებამდე.

3. პრაიმერის დიზაინის სახელმძღვანელო:

ა.რეკომენდირებულია, რომ ბოლო ფუძე პრაიმერის 3′ ბოლოს უნდა იყოს G ან C.

ბ.თავიდან უნდა იქნას აცილებული ზედიზედ შეუსაბამობები ბოლო 8 ძირში პრაიმერის 3′ ბოლოს.გ.მოერიდეთ თმის სამაგრის სტრუქტურებს პრაიმერის 3′ ბოლოს.

დ.განსხვავებები Tm მნიშვნელობებში წინა და საპირისპირო პრაიმერი უნდა იყოს არაუმეტეს 1℃ და Tm მნიშვნელობა უნდა დარეგულირდეს 60 ~ 72℃ (პრაიმერი Premier 5 რეკომენდირებულია Tm მნიშვნელობის გამოსათვლელად).

ე.დამატებითი დამატებითი პრაიმერის თანმიმდევრობები, რომლებიც არ შეესაბამება შაბლონს, არ უნდა იყოს ჩართული პრაიმერის Tm მნიშვნელობის გაანგარიშებისას.

ვ.რეკომენდირებულია, რომ პრაიმერის GC შემცველობა იყოს 40%-60%.

გ.A, G, C და T-ის საერთო განაწილება პრაიმერში უნდა იყოს რაც შეიძლება თანაბარი.მოერიდეთ რეგიონების გამოყენებას მაღალი GC ან AT შემცველობით.

თ.მოერიდეთ 5 ან მეტი ბაზის დამატებითი თანმიმდევრობის არსებობას პრაიმერის შიგნით ან ორ პრაიმერს შორის და მოერიდეთ 3 ან მეტი ბაზის დამატებითი თანმიმდევრობის არსებობას ორი პრაიმერის 3' ბოლოს.

მე.გამოიყენეთ NCBI BLAST ფუნქცია პრაიმერის სპეციფიკის შესამოწმებლად, რათა თავიდან აიცილოთ არასპეციფიკური გაძლიერება.