პროტეინაზა K (თხევადი)
კატის ნომერი: HC4502A
პროტეინაზა K არის სტაბილური სერინის პროტეაზა ფართო სუბსტრატის სპეციფიკურობით.ის ანადგურებს ბევრ ცილას მშობლიურ მდგომარეობაში სარეცხი საშუალებების არსებობის შემთხვევაშიც კი.კრისტალებისა და მოლეკულური სტრუქტურის კვლევების მტკიცებულებები მიუთითებს იმაზე, რომ ფერმენტი მიეკუთვნება სუბტილიზინის ოჯახს აქტიური ადგილის კატალიზური ტრიადით (Asp39-მისი69- სერ224).გაყოფის უპირატესი ადგილია პეპტიდური ბმა, რომელიც გვერდითაა ალიფატური და არომატული ამინომჟავების კარბოქსილის ჯგუფთან დაბლოკილი ალფა ამინო ჯგუფებით.იგი ჩვეულებრივ გამოიყენება მისი ფართოსპეციფიკა.
სპეციფიკაცია
| გარეგნობა | უფერო სითხე ღია ყავისფერიდან |
| აქტივობა | ≥800 ე/მლ |
| ცილის კონცენტრაცია | ≥20 მგ/მლ |
| DNase | არცერთი არ არის აღმოჩენილი |
| RNase | არცერთი არ არის აღმოჩენილი |
შენახვის პირობები
ინახება 2-8℃ ტემპერატურაზე.
Თვისებები
| EC ნომერი | 3.4.21.64 (რეკომბინანტი Tritirachium ალბომიდან) |
| Მოლეკულური წონა | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| იზოელექტრული წერტილი | 7.81 |
| ოპტიმალური pH | 7.0-12.0 სურ.1 |
| ოპტიმალური ტემპერატურა | 65 ℃ ნახ.2 |
| pH სტაბილურობა | pH 4.5-12.5 (25℃, 16 სთ) ნახ.3 |
| თერმული სტაბილურობა | 50℃ ქვემოთ (pH 8.0, 30 წთ) ნახ.4 |
| აქტივატორები | SDS, შარდოვანა |
| ინჰიბიტორები | დიიზოპროპილ ფტორფოსფატი;ფენილმეთილსულფონილ ფტორიდი |
აპლიკაციები
1. გენეტიკური დიაგნოსტიკური ნაკრები
2. რნმ და დნმ-ის ექსტრაქციის ნაკრები
3. არაცილოვანი კომპონენტების ექსტრაქცია ქსოვილებიდან, ცილის მინარევების დეგრადაცია, როგორიცაა დნმ ვაქცინები და ჰეპარინის მომზადება
4. ქრომოსომის დნმ-ის მომზადება იმპულსური ელექტროფორეზით
5. ვესტერნ ბლოტი
6. ფერმენტული გლიკოზირებული ალბუმინის რეაგენტები in vitro დიაგნოსტიკა
Სიფრთხილის ზომები
ატარეთ დამცავი ხელთათმანები და სათვალეები გამოყენებისას ან აწონვისას და შეინახეთ კარგად ვენტილირებადი გამოყენების შემდეგ.ამ პროდუქტმა შეიძლება გამოიწვიოს კანის ალერგიული რეაქცია და თვალის სერიოზული გაღიზიანება.ინჰალაციის შემთხვევაში შეიძლება გამოიწვიოს ალერგია ან ასთმის სიმპტომები ან ქოშინი.შეიძლება გამოიწვიოს სუნთქვის გაღიზიანება.
ანალიზი
ერთეულის განმარტება
ერთი ერთეული (U) განისაზღვრება, როგორც ფერმენტის რაოდენობა, რომელიც საჭიროა კაზეინის ჰიდროლიზირებისთვის წუთში 1 μmol ტიროზინის წარმოებისთვის შემდეგ პირობებში.
რეაგენტების მომზადება
რეაგენტი I: 1გრ რძის კაზეინი იხსნება 50მლ 0.1M ნატრიუმის ფოსფატის ხსნარში (pH 8.0), ინკუბირებულია 65-70 ℃ წყალში 15 წუთის განმავლობაში, აურიეთ და იხსნება, გაცივდა წყლით, დარეგულირდა ნატრიუმის ჰიდროქსიდით pH8.0-მდე და ფიქსირდება. მოცულობა 100 მლ.
რეაგენტი II: TCA ხსნარი: 0,1 მ ტრიქლოროძმარმჟავა, 0,2 მ ნატრიუმის აცეტატი, 0,3 მ ძმარმჟავა.
რეაგენტი III: 0.4M Na2CO3გამოსავალი.
რეაგენტი IV: ფორინტის რეაგენტი განზავებულია სუფთა წყლით 5-ჯერ.
რეაგენტი V: ფერმენტის გამხსნელი: 0,1 მ ნატრიუმის ფოსფატის ხსნარი (pH 8,0).
რეაგენტი VI: ტიროზინის ხსნარი:0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 მკმოლ/მლ ტიროზინი გახსნილი 0.2M HCl-ით.
Პროცედურა
1. 0,5 მლ რეაგენტი I წინასწარ თბება 37℃-მდე, დაამატეთ 0,5 მლ ფერმენტის ხსნარი, კარგად აურიეთ და ინკუბაცია 37℃-ზე 10 წუთის განმავლობაში.
2. რეაქციის შესაჩერებლად დაამატეთ 1 მლ რეაგენტი II, კარგად აურიეთ და გააგრძელეთ ინკუბაცია 30 წუთის განმავლობაში.
3. ცენტრიფუგა რეაქციის ხსნარი.
4. აიღეთ 0.5მლ სუპერნატანტი, დაუმატეთ 2.5მლ რეაგენტი III, 0.5მლ რეაგენტი IV, კარგად აურიეთ და ინკუბაცია 37℃-ზე 30წთ.
5. OD660განისაზღვრა როგორც OD1;ცარიელი საკონტროლო ჯგუფი: 0.5მლ რეაგენტი V გამოიყენება ფერმენტული ხსნარის ჩანაცვლებისთვის OD-ის დასადგენად660როგორც OD2, ΔOD=OD1-ოდ2.
6. L-ტიროზინის სტანდარტული მრუდი: 0,5 მლ სხვადასხვა კონცენტრაციის L- ტიროზინის ხსნარი, 2,5 მლ რეაგენტი III, 0,5 მლ რეაგენტი IV 5 მლ ცენტრიფუგის მილში, ინკუბაცია 37℃-ში 30 წუთის განმავლობაში, გამოვლენა OD660L-ტიროზინის სხვადასხვა კონცენტრაციისთვის, შემდეგ მიღებულია სტანდარტული მრუდი Y=kX+b, სადაც Y არის L-ტიროზინის კონცენტრაცია, X არის OD600.
Გაანგარიშება
2: რეაქციის ხსნარის მთლიანი მოცულობა (მლ)
0.5: ფერმენტის ხსნარის მოცულობა (მლ)
0.5: რეაქციის სითხის მოცულობა, რომელიც გამოიყენება ქრომოგენურ განსაზღვრაში (მლ)
10: რეაქციის დრო (წთ)
Df: განზავება მრავალჯერადი
C: ფერმენტის კონცენტრაცია (მგ/მლ)
ცნობები
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.ბიოფისი.რეზ.კომუნ.(1971);44:513.
3. ჰილცი, ჰ.და სხვ.Ევრო.ჯ.ბიოქიმი.(1975);56:103–108.
4. სამბრუკ ჯet ალ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
ფიგურები
ნახ. 1 ოპტიმალური pH
100მმ ბუფერული ხსნარი: pH6,0-8,0, Na-ფოსფატი;pH8.0- 9.0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, გლიცინი-NaOH.ფერმენტის კონცენტრაცია:1მგ/მლ
ნახ. 2 ოპტიმალური ტემპერატურა
რეაქცია 20 მმ K-ფოსფატის ბუფერში pH 8.0.ფერმენტის კონცენტრაცია: 1მგ/მლ
სურ. 3 pH სტაბილურობა
25℃,16 სთ-დამუშავება 50მმ ბუფერული ხსნარით: pH 4.5-5.5, აცეტატი;pH 6,0-8,0, Na-ფოსფატი;pH 8.0-9.0, ტრის-HCl.pH 9,0-12,5, გლიცინი-NaOH.ფერმენტის კონცენტრაცია: 1მგ/მლ
ნახ. 4 თერმული სტაბილურობა
30 წთ-დამუშავება 50მმ Tris-HCl ბუფერით, pH 8.0.ფერმენტის კონცენტრაცია: 1მგ/მლ
ნახ. 5 შენახვა სტაბილურიty at 25℃
