პროტეინაზა K NGS (ფხვნილი)
კატის ნომერი: HC4507A
NGS პროტეაზა K არის სტაბილური სერინის პროტეაზა, მაღალი ფერმენტული აქტივობით და ფართო სუბსტრატის სპეციფიკურობით. ფერმენტი უპირატესად არღვევს ეთერულ ობლიგაციებს და პეპტიდურ კავშირებს ჰიდროფობიური ამინომჟავების, გოგირდის შემცველი ამინომჟავების და არომატული ამინომჟავების C-ტერმინალის მიმდებარედ.ასე რომ, მას ხშირად იყენებენ ცილების მოკლე პეპტიდებად დასაშლელად.NGS პროტეაზა K არის ტიპიური სერინის პროტეაზა Asp39-მისი69-სერ224კატალიზური ტრიადა, რომელიც უნიკალურია სერინის პროტეაზებისთვის, ხოლო კატალიზური ცენტრი გარშემორტყმულია Ca-ით.2+დამაკავშირებელი ადგილები სტაბილიზაციისთვის, ფერმენტის მაღალი აქტივობის შენარჩუნება პირობების უფრო ფართო სპექტრში.
სპეციფიკაცია
| გარეგნობა | თეთრიდან მოთეთრო ამორფული ფხვნილი, ლიოფილიზებული |
| კონკრეტული აქტივობა | ≥40 U/მგ მყარი |
| DNase | არცერთი არ არის აღმოჩენილი |
| RNase | არცერთი არ არის აღმოჩენილი |
| ბიომძიმე | ≤50CFU/გ მყარი |
| ნუკლეინის მჟავის ნარჩენი | <5 პგ/მგ მყარი |
Თვისებები
| წყარო | Tritirachium ალბომი |
| EC ნომერი | 3.4.21.64(რეკომბინანტი Tritirachium ალბომიდან) |
| Მოლეკულური წონა | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| იზოელექტრული წერტილი | 7.81 სურ.1 |
| ოპტიმალური pH | 7.0-12.0 (ყველა ასრულებს მაღალ აქტივობას) ნახ.2 |
| ოპტიმალური ტემპერატურა | 65℃ ნახ.3 |
| pH სტაბილურობა | pH 4,5-12,5 (25℃,16სთ) ნახ.4 |
| თერმული სტაბილურობა | 50℃ ქვემოთ (pH 8.0, 30 წთ) ნახ.5 |
| შენახვის სტაბილურობა | ინახება 25℃ ტემპერატურაზე 12 თვის განმავლობაში ნახ.6 |
| აქტივატორები | SDS, შარდოვანა |
| ინჰიბიტორები | დიიზოპროპილ ფტორფოსფატი;ბენზილსულფონილ ფტორიდი |
შენახვის პირობები
შეინახეთ ლიოფილიზებული ფხვნილი -25~-15℃ ტემპერატურაზე დიდი ხნის განმავლობაში სინათლისგან მოშორებით;დაშლის შემდეგ, ანაწილეთ შესაბამისი მოცულობა მოკლევადიანი შენახვისთვის 2-8℃ სინათლისგან მოშორებით ან ხანგრძლივად შესანახად -25~-15℃ სინათლისგან დაშორებით.
Სიფრთხილის ზომები
ატარეთ დამცავი ხელთათმანები და სათვალეები გამოყენებისას ან აწონვისას და შეინახეთ კარგად ვენტილირებადი გამოყენების შემდეგ.ამ პროდუქტმა შეიძლება გამოიწვიოს კანის ალერგიული რეაქცია და თვალის სერიოზული გაღიზიანება.ინჰალაციის შემთხვევაში შეიძლება გამოიწვიოს ალერგია ან ასთმის სიმპტომები ან ქოშინი.შეიძლება გამოიწვიოს სუნთქვის გაღიზიანება.
ერთეულის განმარტება
NGS პროტეაზა K-ის ერთი ერთეული განისაზღვრება, როგორც ფერმენტის რაოდენობა, რომელიც საჭიროა კაზინის ჰიდროლიზებისთვის 1 μmol L-ტიროზინში სტანდარტული განსაზღვრის პირობებში.
რეაგენტების მომზადება
| Რეაგენტი | მწარმოებელი | კატალოგი |
| კაზეინი ტექნიკურიმსხვილფეხა რქოსანი რძისგან | სიგმა ოლდრიჩი | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2 სთ2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| ტრიქლოროძმარმჟავა | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Ნატრიუმის აცეტატი | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| ძმარმჟავა | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| ნატრიუმის კარბონატი | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| ფოლინი-ფენოლი | Sangon Biotech (შანხაი)კომპანია, შ.პ.ს. | A500467-0100 |
| L-ტიროზინი | სიგმა | 93829 |
რეაგენტი I:
სუბსტრატი: 1% კაზეინი მსხვილფეხა რქოსანი რძის ხსნარიდან: 1 გ ძროხის რძის კაზეინი იხსნება 50 მლ 0,1 მ ნატრიუმის ფოსფატის ხსნარში, pH 8,0, გააცხელეთ წყლის აბაზანაში 65-70 °C 15 წუთის განმავლობაში, აურიეთ და გახსენით, გააგრილეთ წყლით, მორგებული ნატრიუმის ჰიდროქსიდი pH 8.0-მდე და განზავდეს 100 მლ-მდე.
რეაგენტი II:
TCA ხსნარი: 0,1 მ ტრიქლოროძმარმჟავა, 0,2 მ ნატრიუმის აცეტატი და 0,3 მ ძმარმჟავა (აწონეთ 1,64 გ ტრიქლოროძმარმჟავა + 1,64 გ ნატრიუმის აცეტატი + 1,724 მლ ძმარმჟავა თანმიმდევრულად, დაამატეთ 50 მლ დეიონიზებული წყალი, დაარეგულირეთ pH 40-მდე HCl-ზე. 100 მლ).
რეაგენტი III:
0,4 მ ნატრიუმის კარბონატის ხსნარი (აწონეთ 4,24 გ უწყლო ნატრიუმის კარბონატი და იხსნება 100 მლ წყალში)
რეაგენტი IV:
ფოლინის ფენოლის რეაგენტი: განზავდეს 5-ჯერ დეიონიზებული წყლით.
რეაგენტი V:
ფერმენტის გამხსნელი: 0,1 მ ნატრიუმის ფოსფატის ხსნარი, pH 8,0.
რეაგენტი VI:
L-ტიროზინის სტანდარტული ხსნარი:0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 მკმოლ/მლ L-ტიროზინი გახსნილი 0.2M HCl-ით.
Პროცედურა
1. ჩართეთ UV-Vis სპექტროფოტომეტრი და აირჩიეთ ფოტომეტრული გაზომვა.
2. დააყენეთ ტალღის სიგრძე 660 ნმ.
3. ჩართეთ წყლის აბაზანა, დააყენეთ ტემპერატურა 37℃, დარწმუნდით, რომ ტემპერატურა უცვლელი რჩება 3-5 წუთის განმავლობაში.
4. გაახურეთ 0,5 მლ სუბსტრატი 2 მლ ცენტრიფუგის მილში 37℃ წყლის აბაზანაზე 10 წუთის განმავლობაში.
5. ამოიღეთ 0,5 მლ განზავებული ფერმენტის ხსნარი წინასწარ გახურებულ ცენტრიფუგაში 10 წუთის განმავლობაში.დააყენეთ ფერმენტის გამხსნელი, როგორც ცარიელი ჯგუფი.
6. რეაქციის შემდეგ დაუყოვნებლივ დაამატეთ 1.0 მლ TCA რეაგენტი.კარგად აურიეთ და გააჩერეთ წყლის აბაზანაში 30 წუთის განმავლობაში.
7. ცენტრიფუგა რეაქციის ხსნარი.
8. დაამატეთ შემდეგი კომპონენტები მითითებული თანმიმდევრობით.
| Რეაგენტი | მოცულობა |
| სუპერნატანტი | 0,5 მლ |
| 0.4 მ ნატრიუმის კარბონატი | 2,5 მლ |
| ფოლინის ფენოლის რეაგენტი | 0,5 მლ |
9. კარგად აურიეთ წყლის აბაზანაში 37℃ ინკუბაციამდე 30 წუთის განმავლობაში.
10. OD660განისაზღვრა როგორც OD1;ცარიელი საკონტროლო ჯგუფი: ფერმენტის გამხსნელი გამოიყენება ფერმენტის ხსნარის ჩასანაცვლებლად OD-ის დასადგენად660როგორც OD2, ΔOD=OD1-ოდ2.
11. L-ტიროზინის სტანდარტული მრუდი: 0,5 მლ სხვადასხვა კონცენტრაციის L- ტიროზინის ხსნარი, 2,5 მლ 0,4 მ ნატრიუმის კარბონატი, 0,5 მლ ფოლინის ფენოლის რეაგენტი 5 მლ ცენტრიფუგის მილში, ინკუბაცია 37℃ 30 წუთის განმავლობაში, გამოავლინეთ OD660L-ტიროზინის სხვადასხვა კონცენტრაციისთვის, შემდეგ მიღებულია სტანდარტული მრუდი Y=kX+b, სადაც Y არის L-ტიროზინის კონცენტრაცია, X არის OD600.
Გაანგარიშება
2: რეაქციის ხსნარის მთლიანი მოცულობა (მლ)
0.5: ფერმენტის ხსნარის მოცულობა (მლ)
0.5: რეაქციის სითხის მოცულობა, რომელიც გამოიყენება ქრომოგენურ განსაზღვრაში (მლ)
10: რეაქციის დრო (წთ)
Df: განზავება მრავალჯერადი
C: ფერმენტის კონცენტრაცია (მგ/მლ)
ფიგურები
ნახ.1 დნმ-ის ნარჩენი
| ნიმუში | გამზ C4 | ნუკლეინის მჟავა აღდგენა (პგ/მგ) | აღდგენა (%) | სულ ნუკლეიკი მჟავა ( პგ/მგ) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | - | - |
| STD1 | 12.955 |
- |
- |
- |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| რნმ თავისუფალი H2O | განუსაზღვრელი | - | - | - |
ნახ.2 ოპტიმალური pH
ნახ.3 ოპტიმალური ტემპერატურა
ნახ.4 pH სტაბილურობა
ნახ.5 თერმული სტაბილურობა
ნახ.6 შენახვის სტაბილურობა 25℃
