EndoFree Plasmid Maxi Kit
ეს ნაკრები განკუთვნილია 150-300 მლ ბაქტერიული ხსნარიდან, რომელიც კულტივირებულია ღამით, გაუმჯობესებული SDS-ტუტე ლიზისის მეთოდის გამოყენებით ბაქტერიების დასალიზატორად.ნედლი ექსტრაქტი შერჩევით შერწყმულია უნიკალურ ენდოტოქსინის გამწმენდთან და გამოყოფილია ცენტრიფუგაციით ენდოტოქსინების მოსაშორებლად.შემდეგ, სილიკა გელის მემბრანა შერჩევით უერთდება პლაზმიდურ დნმ-ს ხსნარში მაღალი მარილის და დაბალი pH-ის პირობებში.ამას მოჰყვება სარეცხი ბუფერის დამატება მინარევებისაგან და სხვა ბაქტერიული კომპონენტების მოსაშორებლად.დაბოლოს, დაბალი მარილიანი, მაღალი pH გამორეცხვის ბუფერი გამოიყენება სუფთა პლაზმიდური დნმ სილიციუმის მატრიქსის მემბრანიდან გამოსასვლელად.სილიკა გელის მემბრანა იყენებს სპეციალურ ადსორბციულ მემბრანას, ხოლო ადსორბციის რაოდენობის განსხვავება სვეტსა და სვეტს შორის ძალიან მცირეა და განმეორებადობა კარგია.ფენოლი, ქლოროფორმი და სხვა ტოქსიკური რეაგენტები არ არის საჭირო და არც ეთანოლის დალექვის საფეხურებია საჭირო.ეს ნაკრები შეიძლება გამოყენებულ იქნას 0.2-1.5 მგ სუფთა მაღალი ასლის პლაზმური დნმ-ის სწრაფად ამოსაღებად, ექსტრაქციის სიჩქარით 80%-90%.ნაკრები იყენებს უნიკალური პროცესის ფორმულას, რომელიც შლის ენდოტოქსინს, ენდოტოქსინის შემცველობა უკიდურესად დაბალია და უჯრედის ტრანსფექციის ეფექტი შესანიშნავია.მოპოვებული პლაზმიდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას უშუალოდ ფერმენტის მონელების, PCR, ინ ვიტრო ტრანსკრიფციის, ტრანსფორმაციის, თანმიმდევრობის და სხვა მოლეკულური ბიოლოგიის ექსპერიმენტებში.
შენახვის პირობები
RNaseA უნდა ინახებოდეს -30 ~ -15℃ და ტრანსპორტირება ≤0℃ ტემპერატურაზე.
ენდოტოქსინის გამწმენდი შეიძლება ინახებოდეს 2 ~ 8℃ ტემპერატურაზე ერთი თვის განმავლობაში, შენახვა -30 ~ -15℃ გრძელვადიანი შენახვისთვისდა ტრანსპორტირება ≤0℃.
სხვა კომპონენტები უნდა ინახებოდეს ოთახის ტემპერატურაზე (15 ~ 25℃) და ტრანსპორტირება ოთახის ტემპერატურაზე.
კომპონენტები
| კომპონენტები | 10RXNS |
| RNase A | 750 მლ |
| ბუფერი P1 | 75 მლ |
| ბუფერი P2 | 75 მლ |
| ბუფერი P4 | 75 მლ |
| ენდოტოქსინის გამწმენდი | 25 მლ |
| ბუფერი PW | 2 × 22 მლ |
| ბუფერული ტუბერკულოზი | 20 მლ |
| FastPure დნმ Maxi სვეტები (თითოეული 50 მლ კოლექციის ტუბში) | 10 |
| ენდოტოქსინების გარეშე კოლექციური ტუბი | 2 × 5 |
RNaseA:10 მგ/მლ, გამოიყენება რნმ-ის მოსაშორებლად.
ბუფერი P1:ბაქტერიული სუსპენზიის ბუფერი, დაამატეთ RNaseA ბუფერ P1-ს პირველ გამოყენებამდე.
ბუფერი P2:ბაქტერიული ლიზისის ბუფერი (შეიცავს SDS/NaOH).
ბუფერი P4:ნეიტრალიზაციის ბუფერი.
ენდოტოქსინის გამწმენდი:ეფექტურად აშორებს ენდოტოქსინს ნედლი პლაზმიდური ექსტრაქტიდან.
ბუფერი PW:გარეცხეთ ბუფერი, დაამატეთ ეთანოლის განსაზღვრული მოცულობა პირველ გამოყენებამდე.
ბუფერული ტუბერკულოზი:ელუციის ბუფერი.
FastPure დნმ Maxi სვეტები:პლაზმური დნმ-ის ადსორბციის სვეტები.
კოლექციის ტუბები 50 მლ:ფილტრის შეგროვების მილები.
ენდოტოქსინების გარეშე კოლექციური ტუბი:პლაზმიდური დნმ-ის შეგროვების მილები.
მომზადებული მასალები
აბსოლუტური ეთანოლი, იზოპროპანოლი, 50 მლ მრგვალი ფსკერის ცენტრიფუგის მილები და 50 მლ ენდოტოქსინების გარეშეცენტრიფუგის მილები.
აპლიკაციები
ეს პროდუქტი განკუთვნილია პლაზმიდების ფართომასშტაბიანი ექსტრაქციისთვის 150 - 300 მლ ბაქტერიული ხსნარიდან.კულტივირებული ღამით.
ექსპერიმენტის პროცესი
1. აიღეთ 150 – 200 მლ (არაუმეტეს 300 მლ) ბაქტერიული ხსნარი, რომელიც კულტივირებულია ღამით და ცენტრიფუგადაახლოებით 11000 ბრ/წთ (12000 × გ) 1-2 წთ.გადააგდეთ სუპერნატანი და შეაგროვეთ ბაქტერიები.
Δ 50 მლ-ზე მეტი ბაქტერიული ხსნარის შეგროვებისას, ბაქტერიების შეგროვება შესაძლებელია ბაქტერიული ხსნარის დამატებით, ცენტრიფუგით, ზენატანის გადაყრით და სხვა საფეხურებით იმავე 50 მლ მილში.
მრავალჯერ.
2. ცენტრიფუგას დაამატეთ 7,5 მლ ბუფერი P1 (გთხოვთ შეამოწმოთ, დაემატა თუ არა RNaseA ბუფერ P1-ს)ბაქტერიების შემცველი მილი და კარგად აურიეთ მორევით ან პიპეტინგით.
Δ ბაქტერიების სრული ხელახალი სუსპენზია ამ საფეხურზე გადამწყვეტია მოსავლიანობისთვის და არ უნდა იყოს ბაქტერიული გროვა ხელახალი სუსპენზიის შემდეგ.თუ არის ბაქტერიული გროვები, რომლებიც არ არის შერეული, ეს გავლენას მოახდენს ლიზაზე, რაც გამოიწვევს დაბალ მოსავლიანობას და სისუფთავეს.თუ ბაქტერიული ხსნარის OD600 არის 0,65, რეკომენდებულია 7,5 მლ ბუფერი P1-ის გამოყენება 150 მლ ბაქტერიული ხსნარიდან მოპოვებისას;როდესაც OD600 არის 0,75, უნდა იქნას გამოყენებული 8 მლ ბუფერი P1 და შესაბამისად უნდა შეიცვალოს ბუფერების P2 და P4 მოცულობა.თუ ბაქტერიული ხსნარის მოცულობა გაიზარდა 200 მლ-მდე, რეკომენდებულიაბუფერების P1, P2 და P4 მოცულობა პროპორციულად გაიზარდოს.
3. დაამატეთ 7.5 მლ ბუფერი P2 ბაქტერიულ სუსპენზიას მე-2 საფეხურიდან და ნაზად აურიეთ ზევით და ქვევით 6-8ჯერ და ინკუბაცია ოთახის ტემპერატურაზე 4-5 წთ.
Δ ნაზად გადააბრუნეთ, რომ კარგად აურიოთ.მორევა გამოიწვევს გენომის დნმ-ის ფრაგმენტაციას, რის შედეგადაც წარმოიქმნება გენომის დნმ-ის ფრაგმენტები ამოღებულ პლაზმიდში.ამ დროს, ხსნარი ხდება ბლანტი და გამჭვირვალე, რაც აჩვენებს, რომ ბაქტერიები სრულად დაზიანებულია.ხანგრძლივობა არ უნდა აღემატებოდეს 5 წუთს პლაზმიდების განადგურების თავიდან ასაცილებლად.თუ ხსნარი არ არის გამჭვირვალე, შეიძლება გამოიწვიოს ძალიან ბევრი ბაქტერიაარასრული ლიზისი, ამიტომ ბაქტერიების რაოდენობა სათანადოდ უნდა შემცირდეს.
4. დაამატეთ 7.5 მლ ბუფერი P4 ბაქტერიულ სუსპენზიას მე-3 საფეხურიდან და დაუყოვნებლივ გადააქციეთ ნაზად 6-8 ჯერ, რათა ხსნარმა სრულად გაანეიტრალოს ბუფერი P2.ამ დროს უნდა გამოჩნდეს თეთრი ფლოკულენტური ნალექი.ცენტრიფუგა დაახლოებით 11,000 rpm-ზე (12,000 × გ) მეტი სიჩქარით 10-15 წუთის განმავლობაში, ფრთხილად ჩაასხით სუპერნატანი ახალ 50 მლ მრგვალი ფსკერის ცენტრიფუგის მილში (თვით მომზადებული) და თავიდან აიცილოთამოიღეთ მცურავი თეთრი ნალექი.
Δ დაამატეთ ბუფერი P4 და დაუყოვნებლივ გადააქციეთ, რომ კარგად აურიოთ.დატოვეთ მილი მანამ, სანამ თეთრი ნალექი თანაბრად გადანაწილდება მთელ ხსნარში, რათა თავიდან აიცილოთ ადგილობრივი ნალექების წარმოქმნა, რამაც შეიძლება გავლენა მოახდინოს ნეიტრალიზაციაზე.თუ არ არის ერთიანი თეთრი ფლოკულენტური ნალექი ცენტრიფუგაციამდე და სუპერნატანტი არ არის გამჭვირვალე ცენტრიფუგაციის შემდეგ, მილი შეიძლება იყოსცენტრიფუგა კიდევ 5 წუთი.
5. დაამატეთ 0. 1-ჯერ მეტი მოცულობა (ზენატანის მოცულობის 10%, დაახლოებით 2,2 მლ) ენდოტოქსინ სკავენჯერის ზენატანს მე-4 საფეხურიდან და გადააქციეთ შერევისთვის.მოათავსეთ ხსნარი ყინულის აბაზანაში ან ჩადეთ დაქუცმაცებულ ყინულში (ან მაცივრის საყინულეში) 5 წუთის განმავლობაში, სანამ ხსნარი არ გახდება მღვრიედან გამჭვირვალე და გამჭვირვალე.ოდნავ ბუნდოვანი) და ზოგჯერ რამდენჯერმე აურიეთ.
Δ მას შემდეგ, რაც სუპერნატანს დაემატება ენდოტოქსინის გამწმენდი, სუპერნატანი გახდება ბუნდოვანი, მაგრამზენატანი უნდა გახდეს გამჭვირვალე (ან ოდნავ ბუნდოვანი) ყინულის აბაზანაში გაციების შემდეგ.
6. მას შემდეგ, რაც ზენატანი მოთავსდება ოთახის ტემპერატურაზე (>25℃) 10-15 წუთის განმავლობაში, ის გახდება ბუნდოვანი, როგორცმისი ტემპერატურა იზრდება ოთახის ტემპერატურამდე.შემდეგ ზედნადები უნდა გადატრიალდეს, რათა შეურიოს.
Δ თუ ოთახის ტემპერატურა უფრო დაბალია ან გსურთ შეამციროთ ექსტრაქციის დრო, სუპერნატანტის ინკუბაცია შესაძლებელია 37 ~ 42 ℃ წყლის აბაზანაში 5-10 წუთის განმავლობაში და შემდეგი ნაბიჯი შეიძლება განხორციელდეს სუპერნატანტის შემდეგ.ბუნდოვანი ხდება.
7. მოათავსეთ სუპერნატანტის ცენტრიფუგა დაახლოებით 11000 rpm (12000 × g) 10 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე (ტემპერატურა უნდა იყოს >25℃) ფაზის გამოსაყოფად.ზედა წყლის ფაზა შეიცავს დნმ-ს, ხოლო ქვედა ცისფერი ცხიმიანი ფაზის ფენა შეიცავს ენდოტოქსინს და სხვა მინარევებს.გადაიტანეთდნმ-ის შემცველი წყლის ფაზა ახალ მილში დაგადაყარეთ ცხიმიანი ფენა.
Δ ტემპერატურა ცენტრიფუგაციის დროს უნდა იყოს 25℃-ზე მეტი, რადგან ეფექტური ფაზის გამოყოფა არ არისხდება თუ ტემპერატურა ძალიან დაბალია.
Δ თუ ფაზის გამოყოფა არ არის ეფექტური, ცენტრიფუგაციის ტემპერატურა შეიძლება დარეგულირდეს 30℃-მდე დაცენტრიფუგაციის დრო შეიძლება გაიზარდოს 15 წუთამდე.
Δ არ შეწოვოთ ცისფერი ცხიმიანი ფენა, რადგან ის შეიცავს ენდოტოქსინს და სხვა მინარევებს.
მექანიზმი
რეზუსპენზია ლიზისის ნეიტრალიზაცია
◇ დაამატეთ 7,5 მლ ბუფერი P1
◇ დაამატეთ 7,5 მლ ბუფერი P2
◇ დაამატეთ 7,5 მლ ბუფერი P4
ენდოტოქსინის მოცილება
◇ დაუმატეთ 0.1-ჯერ მეტი ზენატანის მოცულობა ენდოტოქსინ სკავენჯერს
შეკვრა და რეცხვა
◇ დაამატეთ 0,5-ჯერ მეტი იზოპროპანოლის მოცულობა
◇ დაამატეთ 10 მლ ბუფერი PW
◇ დაამატეთ 10 მლ ბუფერი PW
ელუცია
◇ დაამატეთ 1 – 2 მლ ბუფერი ტუბერკულოზი ან ენდოტოქსინის გარეშე ddH2O
