დნმ-ის ექსტრაქციის მინი ნაკრები
ეს ნაკრები იყენებს ოპტიმიზებულ ბუფერულ სისტემას და სილიკა გელის სვეტის გამწმენდის ტექნოლოგიას, რომელსაც შეუძლია აღადგინოს 70 bp – 20 kb დნმ-ის ფრაგმენტები TAE ან TBE აგაროზის გელის სხვადასხვა კონცენტრაციიდან.დნმ-ის ადსორბციულ სვეტს შეუძლია სპეციალურად ადსორბირება მოახდინოს დნმ-ს მაღალი მარილის პირობებში.გარდა ამისა, კომპლექტს შეუძლია პირდაპირ გაასუფთავოს დნმ-ის ფრაგმენტები PCR პროდუქტებიდან, ფერმენტული რეაქციის სისტემებიდან ან სხვა მეთოდებით მიღებული ნედლი დნმ პროდუქტებიდან და ამოიღოს მინარევები, როგორიცაა ცილები, სხვა ორგანული ნაერთები, არაორგანული მარილის იონები და ოლიგონუკლეოტიდური პრაიმერები.მას შეუძლია უზრუნველყოს, რომ გაწმენდა შეიძლება დასრულდეს 10-15 წუთში.გასუფთავებული დნმ შეიძლება გამოყენებულ იქნას უშუალოდ ლიგაციისთვის, ტრანსფორმაციისთვის, ფერმენტის მონელებისთვის, ინ ვიტრო ტრანსკრიფციისთვის, PCR-ისთვის, თანმიმდევრობისთვის, მიკროინექციისთვის და ა.შ.
შენახვის პირობები
შეინახეთ -15 ~ -25℃ და გადაიტანეთ ოთახის ტემპერატურაზე.
კომპონენტები
| კომპონენტები | (100 rxns) |
| ბუფერული მშპ | 80 მლ |
| ბუფერი GW | 2 × 20 მლ |
| ელუციის ბუფერი | 20 მლ |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
ბუფერული მშპ:დნმ-ის დამაკავშირებელი ბუფერი.
ბუფერი GW:სარეცხი ბუფერი;გამოყენებამდე დაამატეთ აბსოლუტური ეთანოლი ბოთლზე მითითებული მოცულობით.
ელუციის ბუფერი:ელუცია.
FastPure DNA Mini Columns-G:დნმ-ის ადსორბციის სვეტები.
კოლექციის ტუბები 2 მლ:საკოლექციო მილები ფილტრისთვის.
მომზადებული მასალები
1.5 მლ სტერილიზებული მილები, აბსოლუტური ეთანოლი და იზოპროპანოლი (როდესაც დნმ-ის ფრაგმენტი ≤100 bp, დაამატეთ 1 მოცულობა
იზოპროპანოლი 1 მოცულობის გელამდე), წყლის აბაზანა.
ექსპერიმენტის პროცესი
გამოყენებამდე დაამატეთ 80 მლ ეთანოლი ბუფერულ GW-ს განზავებაში, როგორც ეს მითითებულია ეტიკეტზე, შეინახეთ ოთახის ტემპერატურაზე.
მექანიზმი
1. PCR რეაქციის ხსნარი
გელის ექსტრაქციის სქემა: დაამატეთ თანაბარი მოცულობის ბუფერული GDP PCR რეაქციის ხსნარის აღდგენის სქემა:დაამატეთ 5-ჯერ მოცულობის ბუფერი
2. მშპ გამოთვალეთ გელის მოცულობა (100 μლ უდრის 100 მგ)
დაითხოვოს ლარი
3. წინასწარ გააცხელეთ 50-55 გრადუსზე℃
4. Bind Wash
დაამატეთ 300 μL ბუფერული მშპ*
დაამატეთ 700 μL ბუფერი GW
დაამატეთ 700 μL ბუფერი GW
5. ელუტი
დაამატეთ 20 – 30 μL Elution Buffer ან deionized წყალი
შენიშვნები* PCR რეაქციის სითხის აღდგენა ამ ეტაპის გარეშე
გელის ექსტრაქციის პროგრამა
1. დნმ-ის ელექტროფორეზის შემდეგ დნმ-ის ფრაგმენტების ფრაქციაციისთვის, ამოიღეთ დნმ-ის ფრაგმენტის ერთი ზოლი აგაროზის გელიდან ულტრაიისფერი გამოსხივების ქვეშ.რეკომენდირებულია შთამნთქმელი ქაღალდის გამოყენება გელის აშკარა ტენიანობის შესაწოვად და გელის ნაჭრის ზომის შესამცირებლად ზედმეტი აგაროზის შეძლებისდაგვარად ამოღებით.აწონეთ გელის ნაჭერი (მიკროცენტრიფუგის მილის გარეშე) მისი მოცულობის გამოსათვლელად: 100 მგ გელის ნაჭრის მოცულობა არის დაახლოებით 100 μL, თუ ვივარაუდებთ, რომ სიმკვრივე არის 1გ/მლ.
2. დაამატეთ თანაბარი მოცულობის ბუფერული GDP, ინკუბაცია 50~55℃ 7-10 წუთის განმავლობაში (გელის ზომის მიხედვით, დაარეგულირეთ ინკუბაციური დრო, სანამ ლარი მთლიანად არ დაიშლება).ინკუბაციის დროს 2-ჯერ გადააქციეთ მილი.
Δ ბუფერული მშპ-ის 1-3 ტომის დამატება გავლენას არ მოახდენს დნმ-ის აღდგენის ეფექტურობაზე.თუ აღდგენილი დნმ-ის ფრაგმენტი <100 bp, საჭიროა დაემატოს ბუფერული მშპ 3 ტომი;როდესაც გელის ნაჭერი მთლიანად გაიხსნება, დაამატეთ 1 ტომი იზოპროპანოლი და კარგად აურიეთ, შემდეგ გააგრძელეთ შემდეგი ნაბიჯი.
3. მოკლედ გააკეთეთ ცენტრიფუგა, რათა ნიმუში მიიტანოთ მილის ფსკერზე, ჩადეთ FastPure DNA Mini Columns-G კოლექციურ მილებში 2 მლ, ფრთხილად გადაიტანეთ ხსნარი მაქსიმუმ 700 μL ერთხელ.
დრო ფილტრაციის სვეტებამდე, ცენტრიფუგა 12,000 rpm (13,800 X გ) 30-60 წმ.
4. გადააგდეთ ფილტრატი და დაამატეთ 300 μL ბუფერული GDP სვეტს, ინკუბაცია ოთახის ტემპერატურაზე 1 წუთის განმავლობაში, ცენტრიფუგა 12,000 rpm (13,800 X გ) 30-60 წმ.
5. გადააგდეთ ფილტრატი და დაამატეთ 700 μL ბუფერული GW (შეამოწმეთ წინასწარ დაემატა თუ არა აბსოლუტური ეთანოლი!) სვეტს, ცენტრიფუგა 12000 rpm (13800 X გ) 30-60 წმ.
Δ გთხოვთ, დაამატოთ Buffer GW ადსორბციული სვეტის კედლის გარშემო, ან დაამატეთ Buffer GW უკანა საფარი და აურიეთ იგი თავდაყირა 2-3-ჯერ, რათა დაეხმაროთ მილის კედელზე მიმაგრებული მარილის სრულად ჩამორეცხვას.
6. გაიმეორეთ ნაბიჯი 5.
Δ ბუფერი GW-ით ორჯერ გამორეცხვამ შეიძლება უზრუნველყოს მარილის მთლიანად ამოღება და აღმოფხვრას გავლენა შემდგომ ექსპერიმენტებზე.
7. გადააგდეთ ფილტრატი და ცენტრიფუგა ცარიელი სვეტი 12,000 rpm (13,800 X გ) 2 წუთის განმავლობაში.
8. ჩადეთ სვეტი სუფთა 1,5 მლ მიკროცენტრიფუგის მილში, დაამატეთ 20 - 30 μL Elution Buffer სვეტის მემბრანის ცენტრში, ინკუბაცია 2 წუთის განმავლობაში და შემდეგ ცენტრიფუგა 12,000 rpm (13,800 X გ) 1 წუთის განმავლობაში.გადააგდეთ სვეტი, შეინახეთ მიღებული დნმ -20-ზე.
Δ ნაბიჯი 8-ის სუპერნატანტის გადატანა სვეტში ხელახლა გამორეცხვისთვის და გამორეცხვის ბუფერის წინასწარ გათბობა 55-მდე (როდესაც დნმ-ის ფრაგმენტი >3 კბ) შესაძლოა სასარგებლო იყოს აღდგენის ეფექტურობის გაზრდისთვის.
PCR პროდუქტების აღდგენის პროგრამა
ეს პროტოკოლი გამოიყენება დნმ-ის ფრაგმენტების გასაწმენდად PCR პროდუქტებიდან, ფერმენტული რეაქციის სისტემიდან და დნმ-ის სხვა ნედლი პროდუქტებიდან (გენეტიკური დნმ-ის ჩათვლით).ამ ხსნარს შეუძლია ეფექტურად ამოიღოს სხვადასხვა ნუკლეოტიდები, პრაიმერები, პრაიმერის დიმერები, მარილის მოლეკულები, ფერმენტები და სხვა მინარევები.
1. მოკლედ ცენტრიფუგა PCR პროდუქტები, ფერმენტული რეაქციის ხსნარი და სხვა დნმ ნედლი პროდუქტები.შეაფასეთ მათი მოცულობა პიპეტით და გადაიტანეთ სტერილიზებულ 1,5 მლ ან 2 მლ ტუბში.დაამატეთ ddH2O მოცულობა 100 μL-მდე;ხოლო მაღალი კონცენტრაციის მქონე გენომური დნმ-ისთვის, 300 μL-მდე ddH2O განზავება ხელს შეუწყობს აღდგენის ეფექტურობის გაუმჯობესებას.
2. დაამატეთ ბუფერული მშპ-ის 5 ტომი, კარგად აურიეთ ინვერსიით ან მორევით.თუ საინტერესო დნმ-ის ფრაგმენტი >100 bp, საჭიროა დაემატოს ეთანოლის დამატებითი 1,5 ტომი (ნიმუშები + ბუფერული GDP).
3. დააბრუნეთ სვეტი შეგროვების მილში, გადაიტანეთ ნარევი სვეტში, ცენტრიფუგა 12,000 rpm (13,800 ×g) 30 – 60 წამის განმავლობაში.თუ შერეული ხსნარის მოცულობა აღემატება 700 μL, ჩადეთ ადსორბციული სვეტი შეგროვების მილში, გადაიტანეთ დარჩენილი ხსნარი ადსორბციულ სვეტში და ცენტრიფუგა 12,000 rpm (13,800 × g) 30 – 60 წამის განმავლობაში.
4. შემდეგი შესრულება ეხება 08-1/ლარის მოპოვების პროგრამის 5 – 8 საფეხურს.
აპლიკაციები
TAE ან TBE აგაროზის გელის სხვადასხვა კონცენტრაცია;სხვადასხვა მეთოდით მიღებული PCR პროდუქტები, ფერმენტული რეაქციის სისტემები ან სხვა ნედლი დნმ პროდუქტები.ამოღებული ფრაგმენტები მერყეობდა70 bp -20 kb.
შენიშვნები
მხოლოდ კვლევისთვის.არ გამოიყენება სადიაგნოსტიკო პროცედურებში.
1. გამოყენებამდე დაამატეთ 80 მლ ეთანოლი, რათა განზავდეს ბუფერული GW, როგორც ეს მითითებულია ეტიკეტზე გამოყენებამდე, შეინახეთ ოთახის ტემპერატურაზე.
2. თუ ბუფერული მშპ ადვილად იშლება დაბალ ტემპერატურაზე შენახვის დროს, ის შეიძლება განთავსდეს ოთახის ტემპერატურაზე გამოყენებამდე გარკვეული პერიოდის განმავლობაში.საჭიროების შემთხვევაში, მისი წინასწარ გაცხელება შესაძლებელია 37℃ წყლის აბაზანაში, სანამ ნალექი მთლიანად არ დაიშლება, შემდეგ კი მისი გამოყენება შესაძლებელია შერევის შემდეგ.
3. წინასწარ დააყენეთ წყლის აბაზანის ტემპერატურა 50 ~ 55℃.
4. 08-1/ლარის ექსტრაქციის პროგრამის ნაბიჯი 1, გელის ნაჭრის ზომის მინიმიზაცია მნიშვნელოვნად შეამცირებს დაშლის დროს და გაზრდის აღდგენის ეფექტურობას (ხაზოვანი დნმ ადვილად ჰიდროლიზდება მაღალ ტემპერატურაზე მუდმივი ექსპოზიციის დროს).დნმ-ს გელი დიდი ხნის განმავლობაში არ გაუშვათ UV-ზე, რადგან ულტრაიისფერმა შუქმა შეიძლება გამოიწვიოს დნმ-ის დაზიანება.
5. გელი მთლიანად დაითხოვეთ 08-1/ლარის ექსტრაქციის პროგრამის მე-2 ეტაპზე, წინააღმდეგ შემთხვევაში დნმ-ის აღდგენის ეფექტურობა სერიოზულად დაზარალდება.
6. წინასწარ გააცხელეთ გამორეცხვის ბუფერი ან ddH2O 55℃-მდე, რაც სასარგებლოა დნმ-ის გამორეცხვის ეფექტურობის გასაუმჯობესებლად.რეკომენდირებულია დნმ-ის შენახვა 2,5 მმ Tris-HCl-ის ელუენტში, pH 7,0 – 8,5.
