ვაქცინიის ვირუსის დაფარვის ფერმენტი

ვაქცინიის ვირუსის დაფარვის ფერმენტი მიღებულია რეკომბინანტული E. coli შტამისგან, რომელიც ატარებს გენებს ვაქცინიას დაფარვის ფერმენტისთვის.ეს ერთი ფერმენტი შედგება ორი ქვედანაყოფისგან (D1 და D12) და აქვს სამი ფერმენტული აქტივობა (რნმ ტრიფოსფატაზა და გუანილტრანსფერაზა D1 ქვედანაყოფით და გუანინ მეთილტრანსფერაზა D12 ქვედანაყოფით).ვაქცინიის ვირუსის დაფარვის ფერმენტი ეფექტურია ქუდის სტრუქტურის ფორმირების კატალიზებისთვის, რომელსაც შეუძლია კონკრეტულად მიამაგროს 7-მეთილგუანილატის ქუდის სტრუქტურა (m7Gppp, Cap 0) რნმ-ის 5' ბოლოზე.ქუდის სტრუქტურა (Cap 0) მნიშვნელოვან როლს ასრულებს mRNA სტაბილიზაციაში, ტრანსპორტირებასა და ტრანსლაციაში ევკარიოტებში.ფერმენტული რეაქციით რნმ-ის დაფარვა ეფექტური და მარტივი მეთოდია, რომელსაც შეუძლია მნიშვნელოვნად გააუმჯობესოს რნმ-ის სტაბილურობა და ტრანსლაცია ინ ვიტრო ტრანსკრიფციისთვის, ტრანსფექციისა და მიკროინექციისთვის.

კომპონენტები

ვაქცინიის ვირუსის დაფარვის ფერმენტი (10 U/μL)

10×დაფარვის ბუფერი

შენახვის პირობები

-25-15℃ შესანახად (მოერიდეთ გაყინვა-დათბობის განმეორებით ციკლებს)

შენახვის ბუფერი

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% გლიცეროლი.

ერთეულის განმარტება

ვაქცინიის ვირუსის დაფარვის ფერმენტის ერთი ერთეული განისაზღვრება, როგორც ფერმენტის რაოდენობა, რომელიც საჭიროა 10 pmol GTP-ის 80 ნტ ტრანსკრიპტში 1 საათში 37°C-ზე შესატანად.

Ხარისხის კონტროლი

ეგზონუკლეაზა:ვაქცინიის ვირუსის დაფარვის ფერმენტის 10 U 1μg λ-Hind III დნმ-ით 37 ℃ 16 საათის განმავლობაში არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.

ენდონუკლეაზა:ვაქცინიის ვირუსის დაფარვის ფერმენტის 10U 1μg λDNA 37℃ 16 საათის განმავლობაში არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.

ნიკასე:ვაქცინიის ვირუსის დაფარვის ფერმენტის 10 U 1 μg pBR322 37 ℃ 16 საათის განმავლობაში არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.

RNase:ვაქცინიას ვირუსის დაფარვის ფერმენტის 10U 1.6μg MS2 RNA 4 საათის განმავლობაში 37℃ ტემპერატურაზე არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.

1.coli დნმ:ვაქცინიას ვირუსის დაფარვის ფერმენტის 10 U სკრინინგდება E. coli გენომიური დნმ-ის არსებობისთვის TaqMan qPCR-ის გამოყენებით E. coli 16S rRNA ლოკუსისთვის სპეციფიკური პრაიმერებით.E. coli გენომიური დნმ-ის დაბინძურება არის≤1 E. coli გენომი.

2.ბაქტერიული ენდოტოქსინი: LAL-ტესტი, ჩინური ფარმაკოპეის IV 2020 გამოცემის მიხედვით, გელის ლიმიტის ტესტის მეთოდი, ზოგადი წესი (1143).ბაქტერიული ენდოტოქსინის შემცველობა უნდა იყოს ≤10 EU/mg.

რეაქციის სისტემა და პირობები

1. დაფარვის პროტოკოლი (რეაქციის მოცულობა: 20 μL)

ეს პროცედურა გამოიყენება 10 მკგ რნმ-ის (≥100 ნტ) დაფარვის რეაქციაზე და მისი მასშტაბირება შესაძლებელია ექსპერიმენტული მოთხოვნების შესაბამისად.

I) შეუთავსეთ 10 მკგ რნმ და ნუკლეაზასგან თავისუფალი H2O 1.5 მლ მიკროფუჟის მილში საბოლოო მოცულობამდე 15.0 μL.*10×დაფარვის ბუფერი: 0.5 მ ტრის-HCl, 50 მმ KCl, 10 მმ MgCl2, 10 მმ DTT, (25℃, pH 8.0)

2) გააცხელეთ 65℃ 5 წუთის განმავლობაში, შემდეგ ყინულის აბაზანა 5 წუთის განმავლობაში.

3) დაამატეთ შემდეგი კომპონენტები მითითებული თანმიმდევრობით

*10×დაფარვის ბუფერი: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) ინკუბაცია 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში, რნმ ახლა თავსახურია და მზადაა ქვემოთ გამოსაყენებლად.

2. 5′ ტერმინალი მარკირების რეაქცია (რეაქციის მოცულობა: 20 μL)

ეს პროტოკოლი შექმნილია რნმ-ის მარკირებისთვის, რომელიც შეიცავს 5' ტრიფოსფატს და მისი მასშტაბირება შესაძლებელია მოთხოვნების შესაბამისად.ეტიკეტის ჩართვის ეფექტურობაზე გავლენას მოახდენს რნმ-ის: GTP-ის მოლური თანაფარდობა, ისევე როგორც GTP შემცველობა რნმ-ის ნიმუშებში.

1) შეუთავსეთ რნმ-ის შესაბამისი რაოდენობა და ნუკლეაზასგან თავისუფალი H2O 1.5 მლ მიკროფუჟის მილში საბოლოო მოცულობამდე 14.0 μL.

2) გააცხელეთ 65℃ 5 წუთის განმავლობაში, შემდეგ ყინულის აბაზანა 5 წუთის განმავლობაში.

3) დაამატეთ შემდეგი კომპონენტები მითითებული თანმიმდევრობით.

** GTP MIX ეხება GTP და მარკერების მცირე რაოდენობას.GTP-ის კონცენტრაციისთვის იხილეთმე-3 შენიშვნამდე.

4) ინკუბაცია 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში, რნმ 5′ ბოლო ახლა ეტიკეტირებულია და მზად არის ქვედა დინებისთვის

აპლიკაციები

1. mRNA-ს დაფარვა ტრანსლაციის ანალიზამდე/ინ ვიტრო ტრანსლაციამდე

2. mRNA-ს 5' ბოლოს მარკირება

შენიშვნები გამოყენების შესახებ

1.რნმ-ის ხსნარის გაცხელება ინკუბაციამდე ვაქცინიის დაფარვის ფერმენტით შლის მეორად სტრუქტურას ტრანსკრიპტის მე-5' ბოლოზე.გააგრძელეთ დრო 60 წუთამდე ტრანსკრიპტებისთვის ცნობილი მაღალ სტრუქტურირებული 5' ბოლოებით.

2. რნმ, რომელიც გამოიყენება დაფარვის რეაქციებისთვის, უნდა გაიწმინდოს გამოყენებამდე და შეჩერდეს ნუკლეაზასგან თავისუფალ წყალში.EDTA არ უნდა იყოს წარმოდგენილი და ხსნარი უნდა იყოს მარილების გარეშე.

3. 5' დასასრულის მარკირებისთვის, GTP-ის მთლიანი კონცენტრაცია უნდა იყოს დაახლოებით 1-3-ჯერ აღემატება mRNA-ის მოლარულ კონცენტრაციას რეაქციაში.

4. რეაქციის სისტემის მოცულობა შეიძლება გაიზარდოს ან შემცირდეს რეალურის მიხედვით.