PNGase F
პეპტიდ-N-გლიკოზიდაზა F(PNGase F) არის ყველაზე ეფექტური ფერმენტული მეთოდი გლიკოპროტეინებიდან თითქმის ყველა N-დაკავშირებული ოლიგოსაქარიდის მოსაშორებლად.PNGase F არის ამიდაზა, რომელიც იშლება ყველაზე GlcNAc და ასპარაგინის ნარჩენებს შორის მაღალი მანოზის, ჰიბრიდული და რთული ოლიგოსაქარიდების N-დაკავშირებული გლიკოპროტეინებისგან.
განაცხადი
ეს ფერმენტი სასარგებლოა ცილებიდან ნახშირწყლების ნარჩენების მოსაშორებლად.
მომზადება და სპეციფიკაცია
| გარეგნობა | უფერო სითხე |
| ცილის სისუფთავე | ≥95% (SDS-PAGE-დან) |
| აქტივობა | ≥500000 ე/მლ |
| ეგზოგლიკოზიდაზა | აქტივობა ვერ იქნა აღმოჩენილი (ND) |
| ენდოგლიკოზიდაზა F1 | ND |
| ენდოგლიკოზიდაზა F2 | ND |
| ენდოგლიკოზიდაზა F3 | ND |
| ენდოგლიკოზიდაზა H | ND |
| პროტეაზა | ND |
Თვისებები
| EC ნომერი | 3.5.1.52(რეკომბინანტი მიკროორგანიზმებიდან) |
| Მოლეკულური წონა | 35 კდა (SDS-PAGE) |
| იზოელექტრული წერტილი | 8. 14 |
| ოპტიმალური pH | 7.0-8.0 |
| ოპტიმალური ტემპერატურა | 65 °C |
| სუბსტრატის სპეციფიკა | გლიკოზიდური ბმების გაწყვეტა GlcNAc-სა და ასპარაგინის ნარჩენებს შორის ნახ.1 |
| ამოცნობის საიტები | N- დაკავშირებული გლიკანები, თუ არ შეიცავს α1-3 ფუკოზას ნახ. 2 |
| აქტივატორები | DTT |
| ინჰიბიტორი | SDS |
| Შენახვის ტემპერატურა | -25 ~ -15 ℃ |
| სითბოს ინაქტივაცია | 20 μL რეაქციის ნარევი, რომელიც შეიცავს 1 μL PNGase F ინაქტივირებულია ინკუბაციით 75 °C-ზე 10 წუთის განმავლობაში. |
ნახ. 1 PNGase F-ის სუბსტრატის სპეციფიკა
ნახ. 2 PNGase F-ის ამოცნობა.
როდესაც შიდა GlcNAc ნარჩენები უკავშირდება α1-3 ფუკოზას, PNGase F ვერ წყვეტს N-დაკავშირებულ ოლიგოსაქარიდებს გლიკოპროტეინებისგან.ეს მოდიფიკაცია გავრცელებულია მცენარეებში და ზოგიერთ მწერის გლიკოპროტეინებში.
Cკომპონენტები
|
| კომპონენტები | კონცენტრაცია |
| 1 | PNGase F | 50 მკლ |
| 2 | 10×გლიკოპროტეინის დენატურაციის ბუფერი | 1000 მკლ |
| 3 | 10×გლიკობუფერი 2 | 1000 მკლ |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 მკლ |
ერთეულის განმარტება
ერთი ერთეული(U) განისაზღვრება, როგორც ფერმენტის რაოდენობა, რომელიც საჭიროა 10 მკგ დენატურირებული RNase B-დან ნახშირწყლების >95% ამოსაღებად 1 საათში 37°C ტემპერატურაზე 10 μL რეაქციის საერთო მოცულობით.
რეაქციის პირობები
1. გახსენით 1-20 მკგ გლიკოპროტეინი დეიონიზებულ წყალში, დაამატეთ 1 μl 10×გლიკოპროტეინის დენატურაციის ბუფერი და H2O (საჭიროების შემთხვევაში), რათა მიიღოთ 10 μl რეაქციის მთლიანი მოცულობა.
2.შედგით 100°C-ზე 10 წუთის განმავლობაში, გააგრილეთ ყინულზე.
3.დაამატეთ 2 მკლ 10×გლიკობუფერი 2, 2 μl 10% NP-40 და აურიეთ.
4.დაამატეთ 1-2 μl PNGase F და H2O (საჭიროების შემთხვევაში) მიიღოს 20 μl რეაქციის მთლიანი მოცულობა და აურიეთ.
5.რეაქციის ინკუბაცია 37°C-ზე 60 წუთის განმავლობაში.
6.SDS-PAGE ანალიზისთვის ან HPLC ანალიზისთვის.
