mRNA Cap2'-O-მეთილტრანსფერაზა

mRNA Cap 2' -O-მეთილტრანსფერაზა მიღებული იყო რეკომბინანტული E. coli შტამიდან, რომელიც ატარებს გენს ვაქცინიის mRNA Cap 2 ´-O-მეთილტრანსფერაზასთვის.ეს ფერმენტი ამატებს მეთილის ჯგუფს პირველი ნუკლეოტიდის 2'-O პოზიციაზე, რნმ-ის მე-5' ბოლოში თავსახურის სტრუქტურის მიმდებარედ. ფერმენტი იყენებს S-ადენოსილმეთიონინს (SAM), როგორც მეთილის დონორს, რომ მეთილატირებული რნმ-ის (ქუდი) -0) შედეგად მიიღება cap- 1 სტრუქტურა.

Cap1 სტრუქტურას შეუძლია გაზარდოს ტრანსლაციის ეფექტურობა, გააუმჯობესოს mRNA-ს ექსპრესია ტრანსფექციისა და მიკროინექციების ექსპერიმენტებში. ეს ფერმენტი სპეციალურად საჭიროებს რნმ-ს m7GpppN თავსახურით, როგორც სუბსტრატს.მას არ შეუძლია გამოიყენოს რნმ pN, ppN, pppN ან GpppN 5' ბოლოზე.დახურული რნმ შეიძლება მომზადდეს ინ ვიტრო ტრანსკრიფციის გზით, ქუდის ანალოგის გამოყენებით ან ფერმენტული დაფარვის მეშვეობით Vaccinia Capping Enzyme-ის გამოყენებით.

კომპონენტები

mRNA Cap 2´-O-მეთილტრანსფერაზა (50 U/μL)

10×დაფარვის რეაქციის ბუფერი

შენახვა

-25-15℃ შესანახად (მოერიდეთ გაყინვა-დათბობის განმეორებით ციკლებს).

შენახვის ბუფერი

20 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% გლიცეროლი.

ერთეულის განმარტება

ერთი ერთეული განისაზღვრება, როგორც ფერმენტის რაოდენობა, რომელიც საჭიროა 10 პმოლი 80 ნტ-იანი რნმ-ის ტრანსკრიპტის მეთილაციისთვის 1 საათში 37°C ტემპერატურაზე.

ხარისხის კონტროლის ანალიზები

ეგზონუკლეაზა:50 U mRNA Cap 2' -O-მეთილტრანსფერაზა 1μg λ-Hind III დაიჯესტი დნმ-ით 37 ℃ 16 საათის განმავლობაში არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.

ენდონუკლეაზა: 50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase 1 μg λDNA 37℃ 16 საათის განმავლობაში არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.

ნიკასე: 50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase 1μg pBR322 37 ℃ 16 საათის განმავლობაში არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.

RNase: 50 U mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase 1.6μg MS2 RNA 4 საათის განმავლობაში 37℃ ტემპერატურაზე არ იძლევა დეგრადაციას, როგორც ეს განისაზღვრება აგაროზის გელის ელექტროფორეზით.

E. coli დნმ: mRNA Cap 2' -O-მეთილტრანსფერაზას 50 U სკრინინგდებაE. coli გენომიური დნმ TaqMan qPCR-ის გამოყენებით სპეციფიკური პრაიმერებითE. coli 16S rRNA ლოკუსი.TheE. coli გენომიური დნმ-ის დაბინძურება არის =1E. coli გენომი.

ბაქტერიული ენდოტოქსინი: LAL-ტესტი, ჩინური ფარმაკოპეის IV 2020 გამოცემის მიხედვით, გელის ლიმიტის ტესტის მეთოდი, ზოგადი წესი (1143).ბაქტერიული ენდოტოქსინის შემცველობა უნდა იყოს =10 EU/მგ.

რეაქციის სისტემა და პირობები

1. შეუთავსეთ შესაბამისი რაოდენობა დახურული რნმ და RNase-ისგან თავისუფალი H2O 1.5 მლ მიკროფუჟის მილში საბოლოო მოცულობამდე 16.0 μL.

2. გააცხელეთ 65℃ 5 წუთის განმავლობაში, შემდეგ ყინულის აბაზანა 5 წუთის განმავლობაში.

3. დაამატეთ შემდეგი კომპონენტები მითითებული თანმიმდევრობით (დახურული რნმ-ის მეთილაციისთვის

10-ზე ნაკლები

*10× დაფარვის რეაქციის ბუფერი: 500 mM Tris-HCl (pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. ინკუბაცია 37℃-ზე 1 საათის განმავლობაში (200 ნტ-ზე ნაკლები სამიზნე ფრაგმენტისთვის რეკომენდირებულია ინკუბაციის 2 საათი).

აპლიკაციები

მიკროინექციებისა და ტრანსფექციის ექსპერიმენტების დროს mRNA გამოხატვის გასაუმჯობესებლად.

შენიშვნები გამოყენების შესახებ

1. რეაქციამდე რნმ უნდა გაიწმინდოს და გაიხსნას ნუკლეაზასგან თავისუფალ წყალში, ყველა ხსნარი არ უნდა შეიცავდეს EDTA-ს და იონებს.

2. რეკომენდირებულია რნმ-ის ნიმუშის გაცხელება 65℃ ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში რეაქციამდე, რათა ამოიღონ მეორადი სტრუქტურა ტრანსკრიპტის მე-5' ბოლოზე.ის შეიძლება გაგრძელდეს 10 წუთამდე რთული 5'-ტერმინალის სტრუქტურისთვის.