ორჯაჭვიანი რნმ (dsRNA) ELISA KIT

ეს ნაკრები არის ფერმენტთან დაკავშირებული იმუნოსორბენტული ანალიზი (ELISA) დაწყვილებული ბიოტინ-სტრეპტავიდინის სისტემასთან, დსრნმ-ის რაოდენობრივი გაზომვისთვის 60 ბაზის წყვილზე (bp)-ზე მეტი სიგრძით, მიუხედავად თანმიმდევრობისა.ფირფიტა წინასწარ დაფარულია ანტი-dsRNA ანტისხეულით.ნიმუშში არსებული dsRNA ემატება და უერთდება ჭაბურღილებზე დაფარულ ანტისხეულებს.და შემდეგ ემატება ბიოტინილირებული ანტი-dsRNA ანტისხეული და უკავშირდება ნიმუშში dsRNA-ს.გარეცხვის შემდეგ ემატება HRP-სტრეპტავიდინი და უკავშირდება ბიოტინილირებულ ანტი-dsRNA ანტისხეულს.ინკუბაციის შემდეგ შეუკავშირებელი HRP-სტრეპტავიდინი გამოირეცხება.შემდეგ ემატება TMB სუბსტრატის ხსნარი და კატალიზდება HRP-ით, რათა წარმოიქმნას ლურჯი ფერის პროდუქტი, რომელიც შეიცვალა ყვითლად მჟავე შეჩერების ხსნარის დამატების შემდეგ.ყვითელი ფერის სიმკვრივე პროპორციულია ფირფიტაში დაჭერილი dsRNA-ს სამიზნე რაოდენობით.შთანთქმა იზომება 450 ნმ.

განაცხადი

ეს ნაკრები განკუთვნილია ნარჩენი dsRNA-ს რაოდენობრივი გაზომვისთვის.

ნაკრების კომპონენტები

შენახვა და სტაბილურობა

1. გამოუყენებელი ნაკრებისთვის: მთელი ნაკრები შეიძლება ინახებოდეს 2~8℃ ტემპერატურაზე შენახვის ვადა.შენახვის სტაბილურობისთვის თავიდან უნდა იქნას აცილებული ძლიერი განათება.

2. მეორადი ნაკრებისთვის: მიკროფირფიტის გახსნის შემდეგ, გთხოვთ, დაფაროთ გამოუყენებელი ჭები თეფშის დალუქვით და დააბრუნეთ ფოლგის ჩანთაში, რომელიც შეიცავს საშრობი საშუალების შეფუთვას, დალუქეთ ფოლგის ჩანთა zip-დალუქით და დააბრუნეთ 2~8℃ ტემპერატურაზე, რაც შეიძლება მალე გამოყენების შემდეგ.სხვა რეაგენტები უნდა დაბრუნდეს 2~8℃ ტემპერატურაზე, რაც შეიძლება მალე გამოყენების შემდეგ.

საჭირო მასალები, მაგრამ არ არის მოწოდებული

1. მიკროფირფიტის წამკითხველი 450±10 ნმ ფილტრით (უკეთესი თუ შეიძლება აღმოაჩინოს 450 და 650 ნმ ტალღის სიგრძეზე).

2. მიკროფირფიტის შეკერი.

3. RNase-ის გარეშე წვერები და ცენტრიფუგის მილები.

ოპერაციების სქემა

Სანამ დაიწყებ

1. გამოყენებამდე ნაკრების ყველა კომპონენტი და ნიმუში მიიტანეთ ოთახის ტემპერატურაზე (18-25℃).თუ ნაკრები არ იქნება გამოყენებული ერთჯერადად, გთხოვთ, ამოიღოთ მხოლოდ ზოლები და რეაგენტები ამჟამინდელი ექსპერიმენტისთვის და დარჩენილი ზოლები და რეაგენტები დატოვოთ საჭირო მდგომარეობაში.

2. სარეცხი ბუფერი: განზავდეს 40 მლ 20 × კონცენტრირებული სარეცხი ბუფერი 760 მლ დეიონიზებული ან გამოხდილი წყლით 800 მლ 1 × სარეცხი ბუფერის მოსამზადებლად.

3. სტანდარტი: გამოყენებამდე ხსნარი მოკლედ დაატრიალეთ ან ცენტრიფუგა.მოწოდებული ოთხი სტანდარტის კონცენტრაცია არის 5ნგ/მკლ.UTP და pUTP dsRNA სტანდარტებისთვის, გთხოვთ, განზავდეს მარაგის ხსნარი 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0 pg/μL STE ბუფერით სტანდარტული მრუდის გამოსახაზავად.N1-Me-pUTP dsRNA სტანდარტებისთვის, გთხოვთ, განზავდეს მარაგის ხსნარი 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL STE ბუფერით, რათა დახაზოთ სტანდარტული მრუდი.5-OMe-UTP dsRNA სტანდარტისთვის, გთხოვთ, განზავდეს მარაგის ხსნარი 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0 pg/μL STE ბუფერით, რათა დახაზოთ სტანდარტული მრუდი.ჩვენ გირჩევთ, რომ სტანდარტები შეიძლება განზავდეს შემდეგი სქემების მიხედვით:

4. ბიოტინილირებული გამოვლენის ანტისხეული და HRP-სტრეპტავიდინის სამუშაო ხსნარი: გამოყენებამდე მოკლედ დაატრიალეთ ან ცენტრიფუგა.განზავდეს ისინი სამუშაო კონცენტრაციამდე განზავების ბუფერით.

5. TMB სუბსტატია: ამოიღეთ ხსნარის საჭირო დოზა სტერილიზებული წვერით და აღარ ჩაყაროთ ნარჩენი ხსნარი ფლაკონში.TMB სუბსტრატი მგრძნობიარეა სინათლის მიმართ, ნუ აქცევთ TMB სუბსტრატს შუქზე დიდი ხნის განმავლობაში.

პროტოკოლის გამოყენებით

1. განსაზღვრეთ ანალიზისთვის საჭირო ზოლების რაოდენობა.ჩადეთ ზოლები ჩარჩოებში გამოსაყენებლად.დარჩენილი ფირფიტების ზოლები, რომლებიც არ გამოიყენება ამ ანალიზში, ხელახლა უნდა შეიფუთოს ჩანთაში გამშრალებელთან ერთად.მჭიდროდ დახურეთ ჩანთა მაცივარში შესანახად.

2. დაამატეთ 100 μL სტანდარტული, ბლანკი და ნიმუშების განზავება შესაბამის ჭებში.დააფარეთ თეფშის დალუქვით.გააჩერეთ 1 სთ ოთახის ტემპერატურაზე 500 ბრ/წთ შერყევით.ზუსტი ანალიზისთვის ნიმუშები უნდა განზავდეს STE ბუფერით შესაბამის კონცენტრაციამდე.

3. გარეცხვის ეტაპი: შეასხურეთ ხსნარი და ჩამოიბანეთ 250 μL სარეცხი ბუფერით თითოეულ ჭაბურღილზე და გააჩერეთ 30 წმ.სარეცხი ბუფერი მთლიანად გადააგდეთ თეფშზე შთამნთქმელ ქაღალდზე დაჭერით.მთლიანად დაიბანეთ 4-ჯერ.

4. თითოეულ ჭაბურღილში დაამატეთ 100 მკლ ბიოტინილირებული გამოვლენის ანტისხეულების სამუშაო ხსნარი.დააფარეთ თეფშის დალუქვით.გააჩერეთ 1 სთ ოთახის ტემპერატურაზე 500 ბრ/წთ შერყევით.

5. გაიმეორეთ სარეცხი ნაბიჯი.

6. თითოეულ ჭაბურღილში დაამატეთ 100 μL HRP-სტრეპტავიდინის სამუშაო ხსნარი.დააფარეთ თეფშის დალუქვით.გააჩერეთ 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე 500 ბრ/წთ შერყევით.

7. კვლავ გაიმეორეთ სარეცხი ნაბიჯი.

8. თითოეულ ჭაბურღილში დაამატეთ 100 μL TMB სუბსტრატის ხსნარი.დააფარეთ თეფშის დალუქვით.ინკუბაცია 30 წუთის განმავლობაში RT დაიცავით სინათლისგან.სითხე ლურჯდება სუბსტრატის ხსნარის დამატებით.

9. თითოეულ ჭაბურღილში დაამატეთ 50 μL გაჩერების ხსნარი.სითხე გაყვითლდება გაჩერების ხსნარის დამატებით.შემდეგ გაუშვით მიკროპლატის წამკითხველი და ჩაატარეთ გაზომვა 450 ნმ-ზე დაუყოვნებლივ.

შედეგების გაანგარიშება

1. შეადგინეთ საშუალოდ დუბლიკატი წაკითხვები თითოეული სტანდარტისთვის, კონტროლისთვის და ნიმუშებისთვის და გამოაკლეთ საშუალო ნულოვანი სტანდარტული ოპტიკური სიმკვრივე.ააგეთ სტანდარტული მრუდი შთანთქმით ვერტიკალურ (Y) ღერძზე და dsRNA კონცენტრაციით ჰორიზონტალურ (X) ღერძზე.

2. რეკომენდირებულია კალკულაციის ჩატარება კომპიუტერზე დაფუძნებული მრუდის მორგების პროგრამული უზრუნველყოფით, როგორიცაა curve expert 1.3 ან ELISA Calc 5 ან 4 პარამეტრიანი არაწრფივი მორგების მოდელში.

Შესრულება

1. მგრძნობელობა:

გამოვლენის ქვედა ზღვარი: ≤ 0,001 pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA-სთვის).

რაოდენობრივი ქვედა ზღვარი: 0,0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA-სთვის), 0,0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA-სთვის), 0,0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA-სთვის).

2. სიზუსტე: ინტრა-ანალიზის CV ≤10%, ინტერ-ანალიზის CV ≤10%

3. აღდგენა:80%~120%

4.წრფივიობა:0,0156-0,5პგ/მკლ(UTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1პგ/მკლ(N1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1პგ/მლ(5-OMe-UTP-dsRNA-სთვის).

მოსაზრებები

1. TMB რეაქციის ტემპერატურა და დრო კრიტიკულია, გთხოვთ აკონტროლოთ ისინი მკაცრად ინსტრუქციის მიხედვით.

2. ანალიზის კარგი განმეორებადობისა და მგრძნობელობის მისაღწევად, აუცილებელია ფირფიტების სათანადო რეცხვა, რათა მოხდეს ზედმეტი რეაგენტების მოცილება.

3. გამოყენებამდე ყველა რეაგენტი საფუძვლიანად უნდა იყოს შერეული და ნიმუშის ან რეაგენტის დამატებისას არ წარმოიქმნება ბუშტუკები.

4. თუ კონცენტრირებულ სარეცხ ბუფერში წარმოიქმნება კრისტალები (20x), გაათბეთ 37℃-მდე და ნაზად აურიეთ სანამ კრისტალები მთლიანად არ დაიშლება.

5. მოერიდეთ ნატრიუმის აზიდის (NaN3) შემცველი ნიმუშების ანალიზს, რადგან ამან შეიძლება გაანადგუროს HRP აქტივობა, რაც გამოიწვევს dsRNA ოდენობის არასაკმარის შეფასებას.

6. მოერიდეთ RNase დაბინძურებას ანალიზის დროს.

7. სტანდარტი/ნიმუში, გამოვლენის ანტისხეული და SA-HRP ასევე შეიძლება ჩატარდეს RT-ზე შერყევის გარეშე, მაგრამ ამან შეიძლება გამოიწვიოს გამოვლენის მგრძნობელობის ერთჯერ დაქვეითება.ამ შემთხვევაში, ჩვენ გირჩევთ UTP და pUTP dsRNA სტანდარტები განზავდეს 2pg/μL-დან, N1-Me-pUTP dsRNA სტანდარტები უნდა განზავდეს 4pg/μL-დან და 5-OMe-UTP dsRNA სტანდარტი განზავდეს 8pg/μL-დან.გარდა ამისა, ინკუბაციით HRP-სტრეპტავიდინის სამუშაო ხსნარი 60 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე.არ გამოიყენოთ კოლბის შეკერი, რადგან კოლბის შეკერი შეიძლება გამოიწვიოს არაზუსტი შედეგი.

ტიპიური შედეგი

1. სტანდარტული მრუდის მონაცემები

2. სტანდარტული მრუდის გაანგარიშება

3. ლაინერის გამოვლენის დიაპაზონი:0.0312- 1პგ/მკლ